文档介绍：第三军医大学
硕士学位论文
Bmi1基因在肺腺癌干细胞样细胞自我更新、增殖中作用的在体
研究
姓名:周菁
申请学位级别:硕士
专业:肿瘤学
指导教师:胡义德
2011-05
第三军医大学硕士学位论文 
Bmi1 基因在肺腺癌干细胞样增殖中作用的在体研究

摘要

非小细胞肺癌(NSCLC)是威胁人类健康的常见恶性肿瘤,其发病率和死亡率稳居各
类癌症之首。肿瘤干细胞理论认为,在肿瘤组织中存在少量具有干细胞特性的细胞,这
些细胞在肿瘤形成、发展、转移和复发中具有重要作用。近年来,大量研究证明了肺癌
干细胞(LCSCs)的存在。正常小鼠肺组织中有一群具有干细胞特征的细胞,被称为支气
管肺泡干细胞(bronchoalveolar stem cells,BASCs),其表面标记是 Sca-1+/CD34+。还有研
究发现,人肺癌组织中部分具有 CD133+表型的细胞,具有自我更新和在免疫缺陷小鼠
体内成瘤的能力。肺癌干细胞的发现,给非小细胞肺癌的肿瘤形成和化疗抵抗等机制的
进一步研究,以及改善肺癌患者的生存率方面,带来了新的希望。
在目前的研究中,主要有三种富集肺癌干细胞的方法,包括: (1)分选表面标志物
CD133+的细胞;(2)利用干细胞能泵出 Hoechst33342 染料的特性,分选“侧群细胞”(side
populations cells, SP);(3)利用悬浮培养获得的“细胞球”的方法富集干细胞。但这些方
法目前所获得的细胞都只是“富含”干细胞的异质细胞群,数量有限,且在维持干细胞
“干性”方面存在较大困难。目前认为肺癌干细胞的耐药性与干细胞高表达 ABC 转运
蛋白(ATP-binding cassette transporters, ABC transporters)有关,ABCG2 是这当中最重要
的药泵蛋白,与肿瘤干细胞化疗耐药性密切相关,被认为是肿瘤干细胞的标志之一。利用
肺癌干细胞的耐药性,本实验通过建立肺癌细胞系 A549 小鼠荷瘤模型,同时给予小鼠
低剂量紫杉醇化疗负荷,在体富集肺癌干细胞。利用富集的肺癌干细胞,进一步研究肺
癌干细胞自我更新和增殖机制。
Bmi1 属于多梳基因家族(b of genes, PcG)成员,是与细胞周期和增殖相关的
重要转录抑制子。许多研究表明,在包括非小细胞肺癌在内的多种上皮细胞源性恶性肿
瘤中,存在 Bmi1 的高表达,并且其表达量与肺癌病人的预后存在明显的负相关。近来
有研究表明 Bmi1 在多种干细胞增殖和自我更新中也有重要作用,特别是在肿瘤干细胞
内存在表达增多的现象。但是 Bmi1 是否在维持肺癌干细胞的功能中也有重要作用,目
前尚未见研究报道。
本实验通过在体瘤内注射慢病毒介导的 Bmi1-shRNA,利用 RNA 干扰技术下调非小细
胞肺癌移植瘤内肺癌干细胞的 Bmi1 的表达,发现伴随着 Bmi1 的表达下降,肺癌干细胞的
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体外更新能力,以及在免疫缺陷小鼠体内的成瘤能力都明显下降。同时还检测了 Bmi1 的下
游调控基因之一 p16INK4A 的表达,发现随着 Bmi1 的降低,肺癌干细胞内的 p16INK4A 表达上
调。揭示了 Bmi1 在肺癌干细胞自我更新、增殖过程中的重要作用,p16INK4A 可能是 Bmi1
发挥这些作用的靶基因之一,这为进一步研究肺癌干细胞更新、增殖的分子机制奠定了基础。
目的:
建立 A549 细胞在 NOD/SCID 小鼠皮下移植瘤,给予化疗负荷在瘤内富集肺腺癌干
细胞,通过瘤内注射慢病毒介导的 Bmi1-shRNA,采用 RNA 干扰技术下调肺腺癌干细
胞内 Bmi1 的表达,观察 Bmi1 在肺癌干细胞自我更新、增殖中的作用。
方法:
1. 肺癌干细胞的富集。将 A549 细胞注射到 NOD/SCID 小鼠皮下,建立荷瘤小鼠模
型。通过给予小鼠腹腔注射低剂量紫杉醇以及瘤块细胞在体传代,获得第三代移植瘤细
胞 A549-3rd。流式细胞仪检测 A549-3rd 细胞中 CD133+细胞比例,real-time RT-PCR 和
Western blotting 技术检测 A549-3rd 细胞中 Bmi1 及 ABCG2 表达水平。
2. RNA 干扰抑制肺癌干细胞内 Bmi1 的表达。包含人 Bmi1-shRNA 及阴性对照
NC-shRNA 的慢病毒表达载体由上海吉凯基因化学技术公司设计合成并鉴定,该载体表
达绿色荧光蛋白 GFP。荷瘤小鼠随机分成 3 组,分别给予瘤内注射 vsh-Bmi1, vsh-NC 或
PBS。活体