文档介绍：生物化学实验讲义实验一蛋白质性质实验——。。。,了解沉淀蛋白质几种方法及其实用意义。,一、茚三***、羟脯氨酸与茚三***反应产生黄色物质外,所有α—氨基酸及一切蛋白质都能与茚三***反应生成蓝紫色物质。β-丙氨酸、氨与许多一级***都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二***吡唪与肽键上亚氨基不呈现此反应。因此,虽然蛋白质与氨基酸均有茚三***反应,但能与茚三***呈阳性反应不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中,应严防干扰物存在。该反应十分灵敏,1∶1500000浓度氨基酸水溶液即能给出反应,是一种常用氨基酸定量测定方法。茚三***反应分为两步,第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3与醛,水合茚三***被还原成还原型茚三***;第二步是所形成还原型茚三***同另一个水合茚三***分子与氨缩合生成有色物质。此反应适宜pH为5~7,同一浓度蛋白质或氨基酸在不同pH条件下颜色深浅不同,酸度过大时甚至不显色。、仪器与试剂蛋白质溶液;新鲜鸡蛋清溶液(蛋清∶水=1∶9);%甘氨酸溶液;%茚三***水溶液;%茚三***-①%甘氨酸溶液1ml,%茚三***水溶液,混匀,在沸水浴中加热1~2分钟,观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。②%甘氨酸溶液,风干后,%茚三***乙醇溶液,在微火旁烘干显色,观察紫红色斑点出现。二、,如酪氨酸与色氨酸,遇***后,可被硝化成黄色物质,该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环氨基酸,所以有黄色反应,苯丙氨酸不易硝化,需加入少量浓硫酸才有黄色反应。、仪器与试剂鸡蛋清溶液;大豆提取液(将大豆浸泡充分吸胀后,研磨成浆状用纱布过滤);头发;指甲;%苯酚溶液;浓***;%色氨酸溶液;%酪氨酸溶液;10%,观察各管出现现象,有试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后,于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性,观察颜色变化。管号1234567材料(滴)%%酪氨酸4浓***/(滴)244040444现象三、蛋白质沉淀反应蛋白质是亲水胶体,当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后,即自溶液中沉淀析出,此现象叫蛋白质沉淀反应。(一)—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降,故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时,蛋白质即自溶液中沉淀析出。盐析作用与两种因素有关:①蛋白质分子被浓盐脱水;②分子所带电荷被中与。蛋白质盐析作用是可逆过程,用盐析方法沉淀蛋白质时,较少引起蛋白质变性,经透析或用水稀释时又可溶解。盐析不同蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及pH有关。分子量大蛋白质(如球蛋白)比分子量小(如清蛋白)易于析出。球蛋白在半饱与硫酸铵溶液中即可析出,而清蛋白需在饱与硫酸铵溶液中才能析出。、仪器与试剂鸡蛋清溶液(蛋清∶水=1∶9);固体硫酸铵;饱与硫酸铵溶(称取377g硫酸铵溶于20℃500ml蒸馏水中。硫酸铵在20℃水中溶解度为754g/L水。配制时需称取稍过量硫酸铵使溶液中有少量固体存在,同时可加热助溶)。,再加入等量饱与硫酸铵溶液,混匀后静止数分钟则析出球蛋白沉淀。将管内混合液过滤,向滤液中加入硫酸铵粉末,至硫酸铵饱与不再溶解为止,此时析出沉淀为清蛋白。(二),重金属盐类(如Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等)易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全,故常用重金属盐除去液体中蛋白质。但应注意,在使用某些重金属盐(如硫酸铜或醋酸铅)沉淀蛋白质时,不可过量,否则将引起沉淀再溶解。、仪器与试剂鸡蛋清溶液(蛋清∶水=1∶9);5%CuS04溶液;3%,向各管分别滴加2-3滴加5%CuS04溶液、3%AgNO3溶液,观察各管所生成沉淀。在硫酸铜产生蛋白质沉淀试管中,倒掉大部分沉淀,留少量沉淀,继续加入5%CuS04溶液,观察沉淀溶解。(三)—类含氮碱性物质。凡能使生物碱沉淀,或能与生物碱作用产生颜色反应物质,称为生物碱试剂。如鞣酸、苦味酸与磷钨酸等。当蛋白质溶