文档介绍：碱性蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及发酵条件优化摘要通过测量比较牛奶平板上透明圈的大小,从土壤中筛选出一株高产碱性蛋白酶的菌株BP-10,通过产碱性菌株生理生化试验,16SrDNA序列鉴定为专性嗜碱性芽孢杆菌Bacilluspseudofirmus。(BP-10)出发,确定了其最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是蛋白胨,,。关键词碱性蛋白酶筛选鉴定培养发酵优化碱性蛋白酶(AlkalineProtease)是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,广泛存在于动、植物及微生物生物体中,在猪的胰脏中最早被发现【1】【2】。1945年瑞士DrJaag等人在地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)中发现了碱性蛋白酶【3】。碱性蛋白酶作为工业催化剂已广泛应用于制革、银回收、医药、食品加工、饲料、化学工业、废物处理等行业,尤其是作为无磷洗衣粉的添加剂应用广泛【4】,目前碱性蛋白酶的销售量大约占全世界每年总销售量的30%左右【5】。但洗涤剂用碱性蛋白酶要求其在广泛的pH和温度围保持较高的酶活力和稳定性,同时还必须与含有多种氧化剂、鳌合剂和表面活性剂的洗衣粉相融合。目前,在工业应用中的很多碱性蛋白酶存在弊端,例如在表面活性剂、氧化剂、热稳定性、酸碱稳定性方面及培养基成本较高等【6】【7】。因此,筛选新的高产碱性蛋白酶菌株和对其产碱性蛋白酶的酶学条件研究具有重要的理论意义和应用价值,同时利用基因工程手段进行改造将是以后研究的重点方向。本实验从土壤中筛选出若干产碱性蛋白酶的菌株并摸索了其酶学性质及产酶的最始条件,为后期改造菌种提供了基础。、【8】牛奶培养基:、琼脂粉2g、-、蒸馏水100ml。种子培养基:、、葡萄糖1g、、水100ml。基本发酵培养基:、、、、***-NaHCO3缓冲液(pH10)100ml溶解。以上培养基均在121℃、三***乙酸、酪氨酸、福林试剂、硼砂、葡萄糖、酵母粉、胰蛋白胨及其他试剂均为市售分析纯;所用到的分子试剂均购于生工生物工程。,振荡,静置,,振荡均匀,既得10-1的稀释液,然后以此方法继续稀释得到10-2、10-3的稀释液。(10-1、10-2、10-3)涂布于牛奶平板培养基中,30℃恒温培养24h~48h后,根据透明圈的有无,挑取透明圈直径较大的菌落,进行分离纯化、斜面保藏。复筛将初筛的菌株经斜面活化后接种于种子培养基中,30℃、200rpm培养12h,按2%的接种量接入50mL发酵培养基中,30℃、200rpm培养48h,10000rpm离心5min,取上清液测定蛋白酶活力。-93:Folin试剂显色法【9】。规定将lml酶液在40℃、,每分钟水解酪蛋白产生lμg酪氨酸所需的酶量定义为1个酶活力单位(U/ml)。。使用细菌基因组DNA小量纯化试剂盒提取细菌基因组DNA,PCR所用引物为:16S-F:5'-TGGCTCAG-3'16S-R:5'-TTGTTACGACTT-3'。50μLPCR反应体系:2×TaqMasterMix25μL,上下游引物各2μL,模板DNA1μL,无菌去离子水补充至50μl;程序:95℃,5min;95℃,30s;50℃,30s;72℃,2min;72℃,10min;30个反应循环。产物经琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收测序。登录GenBank数据库,同相关菌株比对,确定筛选出的菌种。、葡萄糖、麦芽糖、淀粉作为唯一碳源的发酵培养基(pH10),其他条件保持一致,将四种培养基灭菌,37°C摇床培养24h,测定酶活,选定最佳碳源。、蛋白胨、豆饼粉、尿素、硫氨酸作唯一氮源的发酵培养基(pH10),选用测定上一组最高酶活的碳源作为唯一碳源,其他条件保持一致,37°C摇床培养24h,测定酶活,选定最佳氮源。