文档介绍：实验二、 ELISPOT —单细胞分析技术基础医学院免疫学教研室徐琦副教授 ELISPOT 简介 ELISPOT 是在 ELISA 技术的基础上建立的体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术。可在单细胞水平检测和计数特异性分泌抗体和细胞因子的细胞,并具有较高的特异性和敏感性,目前正被国内外广泛应用。 ELISPOT 技术的发展?ELISPOT 是20多年前便己研发成功的老技术。 Czerkinsky 等人率先在 1983 年,运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的 B细胞频率。?早期 ELISPOT 的分析条件不是非常理想,成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题无法解决。?直到 1996 年PVDF 薄膜的应用( Forsthuber et al., Science, 1996 ), 才解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比, PVDF 薄膜提供 1,000 倍的较大面积来吸附单株抗体,使 T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏,让呈色斑点集中、清晰、对比色高,大大的提高 ELISPOT Cytokine 分析的敏感度。 1996 年以来随着抗体制备、 PVDF 膜等技术改良, ELISPOT 分析技术已经逐渐达到科研人员的期待,它已是当世公认最灵敏抗原特异性 T细胞的体外检测技术。 ELISPOT 与ELISA 的比较它们最大的不同在于: ?1. ELISA 通过显色反应,在酶标仪上测定吸光度,与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。?2. ELISPOT 也是通过显色反应,在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点,可直接在显微镜下人工计数斑点或通过 ELISPOT 分析系统对斑点进行计数, 1个斑点代表 1个细胞,从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率; ?3. 由于是单细胞水平检测, ELISPOT 比ELISA 和有限稀释法等更灵敏,能从 20万-30 万细胞中检出 1个分泌该蛋白的细胞。?4. 刺激剂激活细胞时,不会影响活化细胞分泌细胞因子。 10 6抗原呈递细胞( APC )中混入特定数量的 IFN- γ+的T淋巴细胞,经下列方法检测: ?ELISPOT ?细胞内细胞因子染色( FACS ) ?ELISA X坐标: 10 6 APC 中实际 IFN- γ+T细胞数量 Y坐标: 各检测方法的检测结果 ELISPOT/FACS/ELISA 检测精确度比较 BD ELISPOT 技术优势?单细胞水平检测分泌到的胞外细胞因子?观察活细胞应答(动态)结果能计数效应细胞,分析效应分子产生频率?#of Spots: cell numbers/ frequency ?size of Spots: relative amount produced ?高灵敏度,高产量,大容量 T 细胞分析成为可行。?只需要少量样本即可进行检测分析。?淋巴细胞在 ELISPOT 分析后依然存活。这使得分析之后可以用于进行增殖,用于更进一步的分析、克隆或者低温储藏成为可能。 BD ELISPOT 应用?移植研究?疫苗开发-亦可评估疫苗效力,或是疫苗注射路径影响?Th0/Th1/Th2 细胞转换分析?自体免疫研究–免疫调节及免疫治疗研究?癌症研究-肿瘤反应 T细胞作用?过敏机制探讨– IL-4 诱导免疫球蛋白亚型转换,其它参与过敏机制之细胞因子研究?传染疾病研究?体液免疫研究– B细胞免疫球蛋白及特定亚型反应的进展研究 BD ELISPOT 原理 实验设计是在 96微孔培养板底部披覆 PVDF 薄膜, 用来吸附特殊挑选、且无毒性(不含 sodium azide 、内*** endotoxin )的单株抗体。 PBMC 经适当分离处理后分配到微孔上,再接受适当的抗原刺激,并将微孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言,记忆性 T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞因子,此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞因子会被 PVDF 薄膜上特异抗体捕获。 ,被捕获的细胞因子可进一步使用生物素( Biotin )标记的一抗来标识,其后再与辣根过氧化物酶标记的亲合素作用,并加入底物使其呈色, 有反应作用的细胞会留下约 10-20mm 大小染色的斑点。 BD ELISPOT 流程 PVDF 膜的微孔板上