文档介绍：胶乳免疫比浊法相关知识很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目,关注胶乳标记技术得技术人员越来越多。本人总结了部分胶乳微球标记技术,并加以分类,以便朋友们查阅:胶乳微球物理吸附:反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面得都就是疏水微球,都可以用来设计被动吸附蛋白。磺酸基微球表面含带有负电荷得磺酸基团,pka大约为2,因此在酸性pH保持稳定。醛基微球表面也带有磺酸基团,但能与蛋白行程共价键。羧基微球表面含带负电荷得羧基基团,在pH5、0以上时保持稳定。带有疏水基团得蛋白得吸附与配位结合,就是最简单与直接得标记方法。这种方法中,微球溶液与含目标蛋白得溶液混合,反应后,未结合得游离蛋白通过清洗步骤除去,从而获得胶体蛋白复合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球(硫酸盐、羧基、醛基表面修饰得微球)。醛基表面修饰微球就是一个特例,其疏水吸附结果取决于后来得共价结合。虽然物理吸附就是不依赖pH得,但反应缓冲液得pH对蛋白得结构有非常大得影响,从而影响蛋白吸附到微球上得反应效率。一般,在被吸附蛋白等电点附近pH时,物理吸附效率会很高。反应步骤:1、  用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml;2、  用反应缓冲液系数胶乳微球到1%;3、  将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中,10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。室温搅拌孵育2hr;4、  离心或超滤,除去未结合蛋白;5、  将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。注意事项:1、  最优蛋白标记量影响因素1)  有效比表面积:粒径减小时,比表面积/mg微球值得增加;2)  胶体稳定性:蛋白对胶乳有稳定与去稳定作用;3)  免疫反应:最近标记量由免疫反应需要决定。2、  胶乳微球中加入蛋白后,快速搅拌混合,利于反应均衡。反应体积就是1ml时,可用移液器吸取蛋白加入微球中,并吹打数次。如果反应体积较大时,用烧杯,边搅拌边加入蛋白,3、  储存缓冲液与反应缓冲液不同时,抗体有脱落得可能;4、  表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落,所以应避免加入。微球共价结合抗体方法:一、一步法1、  准备50mMpH6、0得reactionbuffer,醋酸或MESbuffer更合适2、  用reactionbuffer溶解抗体,使其浓度为1mg/mL。3、  用reactionbuffer悬浮微球,使其浓度为1%w/v4、  边搅拌边将一倍体积得抗体溶液加入到10倍体积得微球悬液中,室温下持续搅拌20分钟5、  准备浓度为10mg/ml(52umol/mL)得EDC溶液,用前准备,现配现用。6、  将计算需求量得EDC溶液加入到上述微球悬液中。(Note6)、7、  室温下,立即调节pH(Note7)、8、  移除未结合得蛋白,并将包被微球用storagebuffer重悬。(Note3and4)B、两步法为了避免EDC将相邻微球之间得蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流,两步法偶联抗体更合适。两步法中,在蛋白加入之前,多余得EDC被移除。两步法中,蛋白也可以使用更高pH得buffer来溶解,从蛋白得稳定性方面与加速蛋白与活化微球之间得交联速度方便考虑,就是非常有利得。B1简单一步法:1、  准备50mMpH6、0得活化buffer,醋酸或MESbuffer更合适;用活化buffer悬浮微球,使其浓度为1%w/v2、  每ml微球悬液加入20m