文档介绍：原代培养肝细胞就是肝细胞移植、生物人工肝得最佳生物材料。长期以来,国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量得研究,但要获得高活率、功能好得肝细胞,至今仍非易事。早期主要用非酶法分离肝细胞,包括机械法(如匀浆法)及螯合法。机械法对肝细胞损伤大,细胞活率低;螯合法就是用可结合Ca2+、Mg2+得螯合剂(如枸橼酸盐或EDTA)分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好,常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。后者对酶浓度及作用时间要求十分严格,且由于胰蛋白酶就是一种强蛋白质消化酶,对肝细胞膜破坏严重,因而易造成肝细胞死亡,导致分离失败。胶原酶消化法对肝细胞损伤较小,虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害,但经培养后可完全修复。胶原酶在消化肝得同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在得蛋白激酶、生长因子或受体,使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生得细胞内、外环境及细胞间得各种改变。这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要得促进作用,有利于肝细胞得培养。这种适应性改变恰恰就是机械分离法所没有得。因此,要获取理想得肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。Seglen二步灌注法为经典得胶原酶消化法,但所需设备较复杂,胶原酶消耗量大。本研究在其基础上略加改进。作者认为,采用胶原酶消化法,胶原酶得用量、作用时间及作用条件就是分离成功与否得关键。胶原酶得浓度过高,作用时间难以控制;浓度过低,则作用时间过长、细胞活率降低。事先用无Ca2+、Mg2+得灌注液进行预灌注,去除Ca2+依赖性粘附因子,使桥粒断裂;然后用含Ca2+得胶原酶消化,胶原酶得作用需要Ca2+得活化,在5mmol/LCa2+浓度下,用浓度为500mg/L得胶原酶37℃条件下消化15min最佳。在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时,温度需保持在0~4℃。肝细胞分离时,pH值宜维持在7、4左右,不低于7、2,最高不超过7、6,否则将对肝细胞造成很大损伤。在肝灌注液中加入适量得小牛血清或者牛血清白蛋白,可以维持细胞代谢与液体渗透压,提高肝细胞成活率。此外,门静脉插管应迅速置入,灌注速度必须保持一致。培养板预处理及培养液选择采用铺过胶原得新培养板与没有铺过胶原得新培养板,铺过胶原得老培养板培养肝细胞比较,发现肝细胞在铺过胶原得新培养板中长势更好。新得培养板使用Sigma公司提供得胶原铺胶,置于37℃恒温箱中过夜后使用。过去选择含8%胎牛血清得WE作培养基,效果不错,但WE价格昂贵,我们试着采用含10%胎牛血清得RPM1640培养基,并在其中加入胰岛素,地塞米松等生长因子,肝细胞生长好。肝细胞得接种密度对其以后得生长状况有很大得影响:密度太小,细胞不易生长;密度太大,肝细胞增殖受到抑制,培养板中缺少足够得空间供细胞伸展。当细胞密度为5×105/ml左右时,试剂及仪器主要试剂:胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松、Ⅳ型胶原酶、锥虫蓝等购自美国Sigma公司。鼠尾胶为自行配制。WilliamsE培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司。BT01-100蠕动泵(保定格兰蠕动泵有限公司)、Sorvall低温离心机(美国Kendro公司),CL-800全自动生化分化仪(日本岛津),XD-101倒置显微镜(南京光学显微镜公司)。HeraeusCO2孵箱(美国Kend