文档介绍：逆转录pcrrt-pcr为反转录rcr(reversetranscriptionpcr)和实时pcr(realtimepcr)共同的缩写。逆转录pcr,或者称反转录pcr(reversetranscription-pcr,rt-pcr),是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。在rt-pcr中,一条rna链被逆转录成为互补dna,再以此为模板通过pcr进行dna扩增。由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”,由依赖rna的dna聚合酶(逆转录酶)来完成。随后,dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成,随每个循环倍增,即通常的pcr。原先的rna模板被rna酶h降解,留下互补dna。rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的rna。rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断,并且可以用于定量监测某种rna的含量。(检测基因表达的方法,参见northernblot法。)rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-timepcr)。为了与逆转录pcr相区别,通常被写作“定量pcr”(quantitativepcr)或者rtq-pcr(real-timequantitativepcr)。实时pcr实时pcr(real-timepcr),属于定量pcr(q-pcr)的一种,以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。realtimepcr的定量使用萤光色素,目前有二种方法。一种是在dsdna中插入特异的萤光色素;另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针(probe)。realtimepcr与reversetranscriptionpcr相结合,能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种rtpcr的组合又被称之为“定量rt-pcr(quantitativert-pcr)”rt-pcr技术相关试剂oligo:多聚体,相当于mrna引物amv(m-mlv):逆转录酶dntp:脱氧核苷酸rnase:rna酶抑制剂pcrbuffer:rt-pcr缓冲液mgcl2:2价镁离子pcr各步骤的目的(一)预变性:破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。使dna充分变性,减少dna复杂结构对扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于基因组来源的dna模板,最好不要吝啬这个步骤。此外,在一些使用热启动taq酶的反应中,还可激活taq酶,从而使pcr反应得以顺利进行。(二)变性--退火--延伸循环:①模板dna的变性:模板dna经加热至93℃左右一定时间后,使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板dna与引物的退火(复性):模板dna经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板dna单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下,以dntp为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链。(三)pcr仪扩增循环后72度延伸10分钟用pcr仪扩增时,(,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因:延伸时间取决于待扩增dn***段的长度。(当然是在反应体系一定的条件下)例如,使用taqdna聚合酶,72度时的碱基掺入率为35-100bp/s,因此延伸速率为1kb/min。根据延伸速率推得,扩增1kb以内的dn***段1min即可,而3-4kb则需要3-4min,依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min,这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外,还有一个作用是:在用普通taq酶进行pcr扩增时在产物末端加a尾的作用,可以直接用于ta克隆的进行。什么是半定量pcr半定量反转录-聚合酶链反应(semi-quantitativereversetranscriptionandpolymerasechainreaction,sqrt-pcr)是近年来常用的一种简捷、特异的定量rna测定方法,通过mrna反转录成cdna,再进行pcr扩增,并测定pcr产物的数量,可以推测样品中特异mrna的相对数量。以半定量rt-pcr为基础建立起来的mrna含量测定技术,较含内标化的rt-pcr定量测定的mrna的方法更为简便可行。这种方法不另设‘内标准,排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异,而且具有明显的剂量-效益关系和良好的重复性。步骤:,,:步骤1,rna抽提质量一定要好,注意污染。内参的选择,常用的有βac