文档介绍：Trizol 使用说明书
一、分离纯化的基本原理
研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化 RNA。RNA 质量的高低常常影响
cDNA 库,RT-PCR 和 Northern Blot 等分子生物学实验的成败。Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试
剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料
无水乙醇、氯仿、Glycogen(可能需要)、 Eppendorf 管(RNase-free)、 Tips
(RNase-free)
三、准备工作
RNase 酶非常稳定,是导致 RNA 降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活,但
限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是 RNase 完全
失活。它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与 RNA 制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套。
RNase 的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用
DEPC 配制的 70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求。取 RNase-free 的物品时必须戴
手套。
1、料制品的处理
尽可能使用无菌,一次性塑料制品,已标明 RNase-Free 的塑料制品,如没有开封使用过通
常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下:
1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入 DEPC 使 DEPC 的终浓度为 %。注意:DEPC 为剧毒物,活
性很强,小心在通风柜中使用。
2)处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入 DEPC 水溶液,使塑料制品的所有部分
都浸泡到溶液中。
3)在通风柜中室温处理过夜。
4)将 DEPC 水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已 DEPC 水处理过的塑料制品的烧杯,高温
高压蒸气灭菌至少 30 分钟。
5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品
250°C 烘烤 3 小时以上。
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四、从组织中提取总 RNA
1)液氮研磨,组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,
再研磨,如此三次,按 50-100mg 组织/ml Trizol 加入 Trizol,转入离心管进行第 2 步操作。
2) 匀浆:组织样品按 50-100mg/mlTrizol 加入 Trizol。另外,组织体积不能超过 Trizol 体积
的 10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需 1-2 分钟。
五、从细胞中提取总 RNA
1) 培养贴壁细胞:不须消化,可直接用Trizol进行消化、裂解,Trizol体积按 10cm2/ml比例加
入。
2) 悬浮细胞可直接收集、裂解,每 1ml Trizol可裂解 5×106动物、植物或酵母细胞,或 107细菌
细胞。
六、操作步骤
1、细胞或组织加 Trizol 后,室温放置 5min,使其充分裂解。注:此时可放入-70℃长期保持。
2、12,000rpm 离心 5min,弃沉淀。
3、按 200ul 氯仿/ml Trizol 加入氯仿,振荡混匀后室温放置 15min。注:禁用漩涡振荡器,以
免基因组 DNA 断裂。
4、4℃ 12,000g 离心 15min。
5、吸取上层水相,至另一离心管中。注:千万不要吸取中间界面;若同时提取 DNA 和蛋白质,
则保留下层酚相存于 4℃冰箱,若只提 RNA,则弃下层酚相。
6、按 异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀,室温放置 5-10min。
7、4℃ 12,000g 离心 10min,弃上清,RNA 沉于管底。
8、按 1ml 75%乙醇/ml Trizol 加入 75%乙醇,温和振荡离心管,悬浮沉淀。
9、 4℃ 8,000g 离心 5min,尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥 5-10min。注:RNA 样品不要过于干燥,否则很难溶解。
11、可用 50ul H2O,TE buffer或 %SDS溶解RNA样品,55-60℃,5-10min。注:H2O、TE或 %SDS
均须用DEPC处理并高压。
12、。注:此方法提取RNA A260/A280值在 - 之间;产率估计:组织标本:
(ug RNA/mg组织)1-10ug,培养细胞(ug RNA/106 Cell):5-15ug。注:组织