文档介绍：最近重新研读了分子克隆第三版,有一个有趣的小发现,好像过去没听人说过。一般测核酸浓度都是用260nm的光吸收值来决定,同时用260/280的比值来判断有无蛋白质污染。~。分子克隆第三版专门提到这种判断核酸纯度的办法是不可靠的。原因在于蛋白质在260nm的消光系数比核酸小很多,即使有相当多的蛋白质污染,这个比值还是接近于理想的比值。另外,260/280比值尤其不能用于评判寡聚核甘酸的纯度,因为嘌呤的消光系数比嘧啶大好多,寡聚核甘酸嘌呤嘧啶组成很可能不平均,所以很可能出现很纯的样品260/280比值却比较小的情况。 你所说的‘消光系数‘,是否就是吸光值的意思?如果你用连续波长测过核酸的吸光度时,就会发现,OD260,恰好是核酸吸光值最大的时候,从200-750,是一条曲线,260时是波峰,而280时,刚好是曲线下降到一半左右时的吸光值。而恰好280又是蛋白质的最佳吸收值。如果纯的核酸,那曲线就是标准的,260/-,如果混有蛋白质,多肽,酚之类的杂质,那280时的吸收峰就变高了,曲线随之发生变形,而260时的吸收峰不变。就如你所说的“原因在 于蛋白质在260nm的消光系数比核酸小很多”,因此260的吸收峰几乎不变。但280时却不一样。这时相反,核酸的消化系数比蛋白质小的多,因此,一旦有污染,280上升很快。因此260/280在有污染的情况下就会变小。所以,用260/280的方法,还是比较可靠的。当然更可靠的,就是用200-750的波长,连续扫描。直接观察核酸的整条曲线,那比光靠260,280两个吸收值,肯定要准确很多。其实平时在我们检测时,我们也会检测230,320,两个值。至于这两值的作用,我稍后再说。其实有230,260,280,320,这四个点。基本上也能确定下这条曲线的该一段的形状了。A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品,(DNA)(RNA)。,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品,A320一般是0。(320差不多也就是那条曲线刚下降到0的时候)。所以,当我们检测260/280后,-,我们可以说其纯度可以,那OD260的值就有效。否则,OD260的值判为无效。你说的嘌噙与嘧啶的吸光值,确实没错。但一般情况下,我们测的都是基因组、tRNA,mRNA、cDNA,所以其CG含量都比较均匀。都适用于这种方法。然而,在测某些CG含量明显不均匀的情况下,比如人工合成的寡核苷酸、引物,在CG含量过大或者过小的情况下,我们就不能用260/280的方法了。不过一般自已合成的引物,都能保证纯度的,买来的引物,或者托公司合成的寡核苷酸,也不需要我们