腺病毒慢病毒载体构建包装纯化服务.pdf

文档介绍：ShineGene Molecular Biotech,Inc.
上海闪晶分子生物科技有限公司
重组腺病毒/慢病毒构建包装服务
为促进国内相关领域的研究进展,上海闪晶分子生物有限公司从 2008 年开始,对国内实验室
开展重组腺病毒/慢病毒构建、包装及扩增服务,可以由客户提供自己的基因,完成腺病毒/慢病
毒构建、鉴定、包装的服务。我们的宗旨是:“专业公司,打造专业服务!”
一、技术路线:
(一)A、腺病毒载体构建:
本系统是以 Ad5 血清型 E1/E3 缺陷型腺病毒 DNA 为骨架,在克隆、包装、扩增等各部条件
做了改进和优化,达到了克隆阳性率更高、质量更可靠、包装稳定、出毒迅速、滴度高等效果。
在此基础上,还拓展了更广泛的应用,可以提供各种带报告基因的,带不同标签的腺病毒构建和
包装服务。所包装的腺病毒已成功应用于信号转导,基因转位,Co-IP,动物实验,干细胞研究等
科研实验。并且可以完成较高难度的克隆构建,包括具有细胞毒性作用基因的腺病毒构建,在短
时间内完成从原始质粒到病毒 DNA 的构建工作。

1) 克隆目的基因到穿梭载体(中介载体)及鉴定
根据客户提供的原始质粒信息确定克隆方案:
a) 如果原始质粒与本系统所用穿梭载体有匹配酶切位点,采用相应的内切酶切下相应片断,
回收并连接到穿梭载体。酶切,测序鉴定;
b) 如果原始质粒与本系统所用穿梭载体没有匹配酶切位点,设计带有特殊接头的引物进行
PCR 扩增,得到目的片断,采用相应的内切酶切下相应片断,回收并连接到穿梭载体。
酶切,测序鉴定;
c) 对于不适用于以上方案或者有特定要求的样品,与客户协商定制具体实施方案
2)克隆目的基因到腺病毒载体 pAdPL 及鉴定
利用重组技术将目的片段的表达框从穿梭载体转移到腺病毒载体。
酶切鉴定阳性克隆,将阳性克隆测序二次鉴定。
B、慢病毒载体构建
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上海闪晶分子生物科技有限公司
慢病毒(Lent virus)载体是以 HIV-1(人类免疫缺陷 I 型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体,
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,达到持久性表达的效果。可有效地感染神经
元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,效果非常理想,
因此具有广阔的应用前景。
(二)病毒包装、扩增:
1) 将鉴定正确的基因克隆到慢病毒载体,与辅助载体一起转染 293T 细胞进行包装;
2) 将包装好的病毒超速离心收集;
3) 将浓缩病毒进行滴定,滴定结果单位为PFU/ml(一般为 5×108 PFU/ml以上,体积为 500μl以
上,根据客户需要,不同量有价格差异)

二、质量控制与鉴定:
1) 测序鉴定
2) 根据特定引物作 RT-PCR 鉴定
3) 蛋白表达鉴定(根据客户要求