蛋白印迹操作规程(Western Blot).pdf

文档介绍：Western Blotting 全攻略 ShineGene
Western Blotting 全攻略

蛋白免疫印迹(Western blotting 或 Immunoblotting)一般由凝胶电泳、样品的印迹和
免疫学检测三个部分组成。第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳,使待测样品中的蛋白质
按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物
上,用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和 PVDF 膜,蛋白转移的方法多用电泳转移(转
移电泳),它又有半干法和湿法之分,现在大多用湿法。第三步是用特异性的抗体检测出已
经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间
接免疫酶标的方法,在用特异性的第一抗体杂交结合后,再用酶标的第二抗体(碱性磷酸酶
(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗第一抗体的抗体)杂交结合,再加酶的底物显
色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于
蛋白表达水平的检测中。
一、基本原理
第一部分:SDS-PAGE 电泳
1、蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-),不同的蛋白在不同的PH值下表现出不同的电荷,
为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关,我们在上样前,通常会进行一些处理(上样
缓冲液)。即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上缓冲液。SDS 即十二烷基磺酸钠
(CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+),是一种阴离子表面活性剂,它可以断开分子内和分子间的
氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构; β-巯基乙醇是强还原剂,它可以断开半胱氨酸
残基之间的二硫键。电泳样品加入样品处理液后,经过高温处理,其目的是将SDS 与蛋白质
充分结合,以使蛋白质完全变性和解聚,并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷;另外
样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料,用于监控整个电泳过程;另外样品处理液中还加入适
量的蔗糖或甘油以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。当样品上
样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极,下方为正极),在凝胶中形成移动界面并带动
凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶,使样
品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。
2、电泳启动时,蛋白样品处于 的上层, 的分离胶层在下层,上槽为负极,下
槽为正极。出现了 PH 不连续和胶孔径大小不连续:启动时 Cl¯解离度大,Pro¯解离度居中,
甘 aaCOO¯解离度小,迁移顺序为()Cl¯> Pro¯ >—COO¯。在 Cl¯与 Pro¯之间和 Pro¯
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与—COO¯之间都将出现低离子区,同时也出现高电势,高电势迫使 Pro¯向 Cl¯迁移,—COO¯
向 Pro¯迁移。如:一个 Cl¯领路,—COO¯推动,蛋白在中间,这样就起到浓缩的作用了。
在浓缩胶运动中,由于胶联度小,孔径大,Pro¯受阻小,因此不同的蛋白质就