质粒抽提试剂盒基本原理.pdf

文档介绍：浅谈质粒抽提试剂盒基本原理
碱裂解法从大肠杆菌中制备质粒,是每个分子生物学实验室都要用到的常规技术,但是大家
对碱法抽提质粒的原理知之甚少。
一、碱法抽提质粒用到的三种溶液及硅酸纤维膜(超滤柱)
溶液 I:50 mM 葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA,pH ;
溶液 II: N NaOH / 1% SDS;
溶液 III:3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸/75%酒精。
二、溶液I中各成分的作用
葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部,因此有些试剂厂商的溶液I没有
葡萄糖成分;EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,其主要目的是为了螯合二价金属离子从
而达到抑制DNase的活性。
三、溶液II中各成分的作用
NaOH主要是为了溶解细胞,释放DNA,因为在强碱性的情况下,细胞膜发生了从bilayer(双
层膜)结构向micelle(微囊)结构的变化;但NaOH易和空气中的CO2发生反应,形成碳酸钠,降
低了NaOH的碱性,所以必须用新鲜的NaOH。SDS与NaOH联用,其目的是为了增强NaOH的强碱性,
同时SDS能很好地结合蛋白,产生沉淀。这一步要记住两点:第一,时间不能过长,因为在这样
的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合,不然基因组DNA会断裂。
四、溶液 III 中各成分的作用
溶液 III 中的醋酸钾是为了使钾离子置换 SDS 中的纳离子而形成了 PDS,因为十二烷基硫酸
钠(sodium dodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(potassium dodecylsulfate,
PDS),而 PDS 是不溶水的,同时一个 SDS 分子平均结合两个氨基酸,钾钠离子置换所产生的大量
沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2 M 的醋酸是为了中和 NaOH,因为长时间的碱性条件会打
断 DNA,所以要中和。基因组 DNA 一旦发生断裂,只要是 50-100 kb 大小的片断,就没有办法再
被 PDS 共沉淀了,所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然最后得到的质粒上总会有大
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量的基因组 DNA 混入,琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总 DNA 条带。75%酒精主要是为了清洗
盐份和抑制 Dnase;同时溶液 III 的强酸性也是为了使 DNA 更好地结合在硅酸纤维膜上。
得到的质粒样品一般用含 RNase(50 ug/ml)的 TE 缓冲