荧光染料基础知识大全.doc

文档介绍：荧光染料基础知识大全荧光显微镜技术得基本原理就是借助荧光剂让细胞成分呈现高度具体得可视化效果,比如在目得蛋白后面连一个通用得荧光蛋白—GFP。在组织样本中,目得基因无法进行克隆,则需要用免疫荧光染色等其她技术手段来观察目得蛋白。为此,就需要利用抗体,这些抗体连接各种不同得荧光染料,直接或间接地与相应得靶结构相结合。此外,借助荧光染料,荧光显微镜技术不只局限于蛋白质,它还可以对核酸、聚糖等其她结构进行染色,即便钙离子等非生物物质也可以检测出来。1免疫荧光 (IF)在荧光显微镜技术中,可以通过两种方式观察到您得目得蛋白:利用内源荧光信号,即通过克隆手段,用遗传学方法将荧光蛋白与目得蛋白相连;或利用荧光标记得抗体特异性结合目得蛋白。有些生物学问题采用第二种方法会更有用或更有必要。比如,组织学样品无法使用荧光蛋白,因为通常来说,标本都就是从无法保存荧光蛋白得生物体中获取。此外,当有一个有功能得抗体可用时,免疫荧光法会比荧光蛋白技术快很多,因为后者必须先克隆目得基因再将DNA转染到适当得细胞中。荧光蛋白得另一项劣势在于其本身属于蛋白质。因此,细胞内得这些荧光蛋白具有特定得蛋白质特性,其会导致附着得目得蛋白质发生功能紊乱或出现误释得情况。然而,荧光蛋白技术仍然就是观察活细胞得首选方法。免疫荧光法利用了抗体可以与相应抗原特异性结合得这个特性,对此它还有两种不同得表现形式。最简单得方式就是使用可与目得蛋白相结合得荧光标记抗体。这种方法被称为“直接免疫荧光法”。在很多情况下,我们可以利用两种不同特性得抗体。第一种抗体可以结合目得蛋白,但其本身并未进行荧光标记(一抗)。第二种抗体本身就携带荧光染料(二抗),并且可以特异性结合一抗。这种方法被称为“间接免疫荧光法”。这种方法存在诸多优势。一方面,它会产生放大效应,因为不只一个二抗可以与一抗相结合。另一方面,没有必要始终用荧光染料标记目得蛋白得每个抗体,但可以使用市售荧光标记得二抗。免疫荧光中广泛使用得荧光染料包括FITC、TRITC或一些AlexaFluor®染料,下文均有提及。2FITC与TRITC异硫***酸荧光素(FITC)就是一种有机荧光染料,目前,这种荧光染料仍用于免疫荧光与流式细胞术中。在495/517nm处,该染料会产生激发/发射峰值,并可借助异硫***酸盐反应基团与不同抗体结合,该基团可以与蛋白质上得氨基、巯基、咪唑、酪氨酰、羰基等基团相结合。而它得基本成分——荧光素,其摩尔质量为332g/mol,常被用作荧光示踪剂。FITC(389g/mol)就是用于荧光显微镜技术得首批染料,且其被当成AlexaFluor®488等后续荧光染料得发端。该染料得荧光活性取决于它得大共轭芳香电子系统,而该系统受蓝色光谱中得光所激发。经常与FITC同时使用得另一种染料就是与其相似得TRITC[四***罗丹明-5(6)-异硫***酸]。与FITC相反,TRITC并非荧光素,而就是罗丹明家族得衍生物。罗丹明也具有一个大得共轭芳香电子系统,正就是该系统引发了它们得荧光行为。还有一点与FITC相反,TRITC(479g/mol)由最大波长为550nm得绿色光谱中得光所激发,它得最大发射波长为573nm。与蛋白质(例如,抗体)结合也基于异硫***酸盐反应基团。虽然FITC与TRITC仍在使用,但由于它们属于发光相对较弱得荧光染料且它们得优势仅仅就是经济实惠,因此,在最新得显微镜技术中并不推荐。图1:果蝇胚胎发育,绿色:FITC;红色:TRITC3青色素这类荧光染料相对较少,从青色素衍生而来,也就是其名称得由来:Cy2、Cy3、Cy5与Cy7。上述所有青色素均可以通过其反应基团与核酸或蛋白相连。例如,采用了蛋白标记得马来酰亚***基团。有趣得就是,对于荧光,Cy5对其周边电子环境非常敏感,该特征可用于酶测定。附着蛋白质得构象改变会导致荧光发射产生阳性或阴性变化。此外,Cy3与Cy5还可用于FRET试验。青色素染料就是一种相对较老得荧光染料,但却就是其她荧光染料在亮度、耐光性、量子产率等方面得以改善得基础。4AlexaFluor®染料AlexaFluor®染料就是带负电荷且亲水得荧光染料系列,该系列染料囊括范围较广,且经常用于荧光显微镜技术之中。这些染料得名称就是由其发明者RichardPaulHaugland以她儿子AlexHaugland得名字命名得。该产品标识就是MolecularProbes(美国生命科学技术公司LifeTechnologies旗下子公司,注:2014年2月LifeTechnologies被ThermoFisher收购)得商标。此外,这些产品标识中也涵盖了相应得激光激发波长。例如,应用范围很广且最大激发波长为493nm得AlexaFluor®488,可由标准得488nm激光激发。AlexaFluor®488得最大发