蛋白质含量测定法..doc

文档介绍：1 实验一蛋白质含量测定法[ 实验目的] 1. 掌握考马斯亮蓝法( Bradford 法)测定蛋白质含量的方法 2. 掌握紫外吸收法测定蛋白质含量的方法一. 考马斯亮蓝法( Bradford 法) [ 实验原理](蓝色) 变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G595 250 max ???????[ 器材与试剂] (一) 器材 1. 722 型和 753 型可见光分光光度计 2. 漩涡混合器 3. 试管 16支(二) 试剂 1. 标准蛋白质溶液,用牛血清清蛋白( BSA ) ,配制成 和 。 2. 考马斯亮蓝 G-250 染料试剂:称 100mg 考马斯亮蓝,溶于 50ml 95% 的乙醇后,再加入 120ml 85% 的磷酸,用水稀释至 1 升。[ 实验方法] 1. 标准方法(1)取 10 支试管,分别编号后按表 1-1 剂量依次加入标准蛋白(或未知蛋白)、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后,立即在漩涡混合器上混合。(2) 加完染料 20min 后, 使用 722 分光光度计( 灵敏度 4), 塑料比色皿,在 595n m 处测量吸光度 A 595。(3) 用标准蛋白浓度( mg/ml ) 为横坐标,用A 595 为纵坐标, 进行直线拟合, 得到标准曲线。根据测得的未知样品的 A 595, 查表即可求得未知样品的蛋白质含量。 2. 微量法取 10 支试管, 分别编号后按表 1-3 剂量依次加入稀释的标准蛋白( 或未知蛋白)、去离子水和考马斯亮蓝染料。其他步骤同上,不过使用 753 分光光度计(狭缝 4)。 3. SDS 干扰实验(1)取5 支试管, 分别编号后按表 1-5 剂量依次加入标准蛋白、 SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后,立即在漩涡混合器上混合。(2) 加完染料 20min 后,使用 753 分光光度计(狭缝 4) ,塑料比色皿,在 595n m 处测量吸光度 A 595。2 [ 实验数据与结果分析] (一) 标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格管号 123456789 10 标准蛋白质( ) 0 未知蛋白质(约 ) 蒸馏水 0 0 考马斯亮蓝 G-250 试剂 对应的吸光度 A 595 根据表 1 ,以 A 595 为纵坐标,标准蛋白质量/(μg )为横坐标,作图 1。图 1 考马斯亮兰标准法 y = x + R 2 = 0 1 0 标准蛋白质量/(μg) A595图1 考马斯亮蓝标准法根据线性拟合公式 y = x + 计算所测溶液的蛋白质的含量分别是 8号管 ,9 号管 0.