文档介绍：免疫共沉淀( co-immunoprecipitation ) 背景?据估计,人体中大约总共可产生 500,000 种蛋白,而单个细胞可以产生 10,000 种。?在这些蛋白中, 80% 不是以独立的方式存在的,而是存在于一个蛋白复合体中。?蛋白-蛋白的相互作用包含在一个细胞网络中,我们形象地称之为通过节点( nodes )连接的枢纽( hubs )。蛋白的相互作用? Standard Techniques Glutathione-S-Transferase Fusion Proteins Affinity Tags Tandem Affinity Purification (TAP) Tags Strep-Tag III Quantitative Proteomics Chemical Crosslinking Two-hybrid Yeast Phage-display ? Universal Verification of Interaction Techniques Co-Immunoprecipitation Confocal Microscopy ? Biophysical Verification of Interaction Techniques Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) GFP-Protein Proximity Imaging Microscopy (GFP-PRIM) Mass Spectroscopy (MS) Atomic Force Microscopy (AFM) Surface Plasmon Resonance (SPR) 实验目的?学****并掌握免疫共沉淀的原理及操作方法, 了解免疫共沉淀结果分析。?了解与免疫共沉淀相关的实验及进展免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。金标准用途:测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。概念及用途 binding wash elution YY Y Y Y 当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x 的抗体免疫沉淀 x,那么与 x 在体内结合的蛋白质 y 也能沉淀下来。实验原理?人脑微血管内皮细胞培养于直径为 6cm 的培养皿,培养大约 90% 以上融合后,倒掉培养液, PBS 洗3次; ?加入 1ml Lysis Buffer ( 20mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1%TritonX-100, 1mM β- Glycerolphosphate, 1mM Na 3 VO 4 , Cocktail proteinase , pH ),冰上放置 30min ,裂解细胞; 实验步骤采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂( NP40 或 Triton X-100) 。每种细胞的裂解条件不一样,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂( % SDS) 。为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂,低温下进行实验。 Na 3 VO 4作用为保护磷酸化的蛋白不会被磷酸酶还原。因此在做磷酸化的信号转导时需添加。?将裂解液转移至 EP 管中, 4℃转鼓摇 15min ,14000g 4 ℃离心 15min ; ?吸取上清液到新 EP 管中,每管加 1μg 对照兔 IgG ,同时加入 Protein A agarose ,4℃转鼓转 30min ,4℃ 10000g 离心 5min ; preclear 及其作用一抗和相应来源的 normal mouse, rat, rabbit or goat IgG 中有相同或相似的成分(如无关 IgG) , 用一抗相应来源的 IgG 与蛋白裂解液和 protein A - agarose 可以去除一抗中无关 IgG 对蛋白裂解液中物质的非特异吸附, 二是可以去除蛋白液中与 protein A - agarose 非特异结合的物质。做 preclear 的 IgG 是不针对特异性抗原的。琼脂糖珠的选择 SEPHAROSE 是注册商品名, 本身是 agarose 做的凝胶。