文档介绍：流式细胞技术 1. 流式细胞技术的特点及影响因素: 特点:“六高一低”高精度、高速度、高灵敏度、高纯度、高效率、高科技含量低分辨率影响因素:“三稳定一确保”细胞荧光染色的实验条件要稳定正交光电测量系统要稳定鞘液流速系统要稳定确保细胞悬液分散均匀,不得混有过量的杂质 2. 流式细胞分析技术在细胞生物学中的应用: 1. 细胞表面分子分析(淋巴细胞分型/ 白细胞分型) 含量、细胞周期/ 细胞凋亡的检测与分析 3. 血小板及其活化分析 4. 胞内蛋白质分析(细胞因子/ 转染率检测) 5. 可溶性蛋白质检测( CBA 法) 6. 细胞功能分析 7. 其他(牛奶微生物检测) 流式细胞仪包括: 光学系统, 液流系统, 数据处理系统, 检测系统原理: 经染色的细胞或微球在悬液中以单行流过高强度光源的焦点,当细胞或微球经过焦点时, 发出一束散射光和(或) 荧光,并经过滤光镜系统收集到达一个光电检测器, 光电检测器把光信号定量转化成电信号,经数字转换器进行数字化后而成整数,然后进行电子存储数据。数据以直方图,二维散点图,等高线图,灰度图以及三维图等多种形式显示, 分析。流式细胞步骤: 1、每组取两个 EP 管, 分别标记为 ISO ( 对照组)和 TEST ( 实验组), 每管加入 100u L 全血; 2、在 TEST 管中加入 5uL 的实验抗体( CD4-FITC,CD8-PE ), ISO 管中加入 5uL 的同型对照抗体,室温避光 20min ; 3、加入 1mL 红细胞裂解液,混匀静置 5min ,再次混匀后静置 3min , 200g 离心 5min , 去上清,每管中加入 PBS 洗液 1mL ,混匀后离心 5min ; 4、重复洗涤一次,每管加入 200uL 洗液重悬,转入流式专用测试管。单细胞悬液的制备技术定量细胞学荧光染色技术定量细胞学荧光染色的质量容易受到多种因素的影响, 从而带来分析结果的误差, 最主要的影响因素有:温度效应、 pH 效应、浓度效应、溶剂效应派若宁及其染色技术 ELISA 基本原理: ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性, 又保留酶的活性。③在测定时, 把受检标本( 测定其中的抗体或抗原) 和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开, 最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后, 底物被酶催化变为有色产物, 产物的量与标本中受检物质的量直接相关, 故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。④由于酶的催化频率很高, 故可极大地地放大反应效果, 从而使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA 常用的四种方法 1. 直接法测定抗原将抗原吸附在载体表面; 加酶标抗体,形成抗原—抗体复合物; 加底物。底物的降解量=抗原量。 2. 间接法测定抗体将抗原吸附于固相载体表面; 加抗体, 形成抗原- 抗体复合物; 加酶标抗体; 加底物。测定底物的降解量=抗体量。 3. 双抗体夹心法测定抗原将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面; 加抗原,形成抗原- 抗体复合物; 加抗原免疫第二种动物获得的抗体,形成抗体抗原抗体复合物; 加