文档介绍：细菌鉴定流程细菌鉴定细菌形态学鉴定 16S rDNA 鉴定生理生化鉴定一、细菌形态学鉴定 -80 ??冰箱中取出菌株放 4??复苏,轻柔混匀后用接种环接一环菌液在培养基平板上划线活化, 根据菌株来源选择适宜的培养基。 2. 放入培养箱倒置培养,实验室一般采用 28??培养,特殊菌株依据该菌最适条件(时间、温度)培养 24-48h 。 3. 纯化:从活化培养基平板上挑取单菌落继续划板培养。 4. 观察记录菌落形态特征:大小( mm ) 、形状、干湿、透明度、颜色、边缘整齐还是,,,,,,, 细菌大 小( mm) 形状干湿透明度颜色边缘注意事项: 1 接种划线应在酒精灯旁边操作 2 培养时应倒置培养,防止污染二、革兰氏染色 1. 涂片固定将纯化后的菌株进行革兰氏染色,滴一滴生理盐水于载玻片上, 无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中, 使其自然干燥, 菌面向上,经火焰固定。注意事项: 菌液涂片时不可过于浓厚, 干燥、固定。固定时通过火焰 1~2 次即可,不可过热,以载玻片不烫手为宜。 2. 染色一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤,具体操作方法是: (1) 加上结晶紫后,染色 1 分钟,水洗。(2) 加上碘液染色 1 分钟,水洗。(3) 加上 95% 酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约 20~60 秒, 水洗,吸去水分。(4) 加上蕃红后,染色 1 分钟,水洗。(5) 吸干或在空气中晾干后,油镜镜检。 3. 结果观察:革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。以均匀分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,都常呈现假阳性。注意事项: ①标本涂片不能太厚,严格按操作要求进行。若涂片较厚,应延长脱色时间,直至不再出现紫色为止。②玻片通过火焰温度不能太高。③碘液变透明,则不能使用。④水洗时动作要轻,沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗,以免把菌体冲掉。三、 16S rDNA 鉴定( 16S rDNA 只能鉴定到属, 需进行生理生化、药敏实验等鉴定到种) 1. 细菌复苏、活化、纯化同细菌形态学鉴定 3. 挑取单菌落至少 2-3 个接到含有 1ml 灭菌纯水的 离心管中混匀。 4. 沸水浴 10min , 12000rmp 离心 2min ,取 上清作为模板,上下游引物各 加到 23ul 体系中, 每个样品做 3 个平行, 进行 PC R 扩增。注意事项: ①使用离心机时一定要配平,防止损坏离心机。②实验前所用离心管、纯水、枪头要灭菌后使用。(若结果不理想则用改良方法) 1. 收集菌体, 或直接从平板上刮取细菌( 直径约 -2mm 左右大小菌落的菌量), 加入含 20ul -% Triton X-100 的 200ul PCR 管中, 充分重悬。 2. 对于较难散开的细菌则可采用 500ul 体积( 同样含 -%Triton X-100 ), 使用超声重悬( 菌体相应增加), 处理后取出 20ul 加入 200ul PCR 管中。 3. 将上述 PCR 管置于沸水中水浴处理 5 分钟, 短暂离心(约 30s )后, 取 1ul 作为模板加入 20ul (或 25ul )体系中,进行 PCR 扩增。 -% Triton X-100 的配置: ① 30% 储备液的配置 Triton X-100 PBS(pH=) 充分混合后,置 37℃~ 40℃水浴中 2~ 3h ,使其充分溶解混匀, 备用。②用前取该储备液稀释至所需浓度,取 1-5ul 储备液加入 300ul 双蒸水中。普通 PCR 体系:( 23ul 反应体系) 50管× PCR 体系配制 ddH2O 10× buffer 125ul dNTP 100ul rTaq ul 1. 配制体系所用的 200 μl PCR 管、 离心管、纯水、 1ml 枪头、 200 μl 枪头、 10μl 枪头均需灭菌,且在无菌操作台中操作。 2. 配制体系前先将 50个 200 μl的 PCR 管放在冰盒上预冷。 3. 取一个无菌的 离心管,依次将药品加入管中,在漩涡混合器上混合 5~10 秒。 23μl分装入 200 μl PCR 管中,放-20 ??备用。 5. 使用体系之前先验证体系是否好用。例如: 取实验室已知菌加 16s 上下游引物进行 PCR 反应, 电泳后凝胶成像系统观察是否有已知条带。注意事项: (1) 10× buffer 、 dNTP 、 rTaq 用完尽快放回-20 ??保存。(2 )无菌操作 PCR 程序: 94 ?? 5min 94 ?? 30s 35 个循环 55 ?? 30s 72