文档介绍：第八章荧光免疫技术Fluoroimmunoassay,FIA?概念:是将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法。?方法:荧光抗体技术(FAT):用荧光素标记抗体进行抗原定位、定量检测等。:某些物质受到一定波长光的激发后,在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。:基态---能量(波长短的光)----激发态---荧光(波长长的光,光致发光)---基态一、荧光的基本知识化学物质基态吸收能量释放能量::即时性(停止供能,荧光现象即止10-7~10-8s):光、化学物质、射线。:固定激发波长,在不同波长下所记录到的样品发射荧光的相对强度。:固定发射波长,用不同波长的激发光激发样品,所记录到的相应的荧光发射强度。:是指荧光物质将吸收的光能转变成为荧光的百分率。荧光效率=发射荧光的光量子数(荧光强度)/吸收光的光量子数(激发光强度):指荧光物质在某些理化因素作用下,发射荧光减弱甚至消退的现象。原因:(1)紫外光照射长;(2)苯***、酚、KI、铁、***、镍等。有利:猝灭剂消除不需要的荧光,如硝基苯处理有荧光的镜油。保存:避光、避免与其它化学物质接触二、荧光物质(一)荧光色素:具有光致荧光的特性。1、荧光色素应具备的条件P87①能与蛋白质共价结合,结合蛋白质后不易解离,而未与蛋白质结合的色素及其降解产物容易被清除②荧光效率高③荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明④结合蛋白质后,不影响蛋白质的生化性质及免疫学活性,而且标记方法简单、快速,结合物稳定,易于保存。⑤安全无毒,不具有附加的抗原性。2、常用的荧光色素:(1)异硫***酸荧光素(FITC)?最大吸收光谱:490-495nm。?最大发射光谱:520-530nm。?荧光颜色:黄绿色。?应用最广:①人眼对黄绿色较橘色更为敏感。②一般切片等标本中绿色的自发荧光少于红色的,本底低。?缺点:易猝灭(2)四乙基罗丹明(RB200)?最大吸收光谱:570nm。?最大发射光谱:595-600nm。?荧光颜色:亮橙、橘红色。?应用:常用于双重标记或对比染色。可作为FITC的补充,但其荧光效率较低。(3)四***异硫***酸罗丹明(TRITC)?最大吸收光谱:550nm。?最大发射光谱:620nm。?荧光颜色:橘红色。?应用:常用于双重标记或对比染色;激发峰和荧光距离较大,易于选择滤光系统。