文档介绍：实验四蔗糖酶活力测定—— -二硝基水杨酸法一、实验目的和要求 1、掌握酶活力测定的基本原理和方法; 2、学****酶的比活力的计算。二、实验基本原理蔗糖酶( β-D- 呋喃型果糖苷-果糖水解酶 EC ),是一种水解酶。它能催化非还原性双糖(蔗糖)的 1,2 -糖苷键裂解,将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖(还原糖) 。因此, 每水解 1mol 蔗糖,就能生成 2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法,例如:纳尔逊-索模吉( Nelson-Smogyi )试剂比色法,斐林试剂法等。本实验采用 -二硝基水杨酸法测定还原糖的含量,由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是 -二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物,在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。因此可利用分光光度计在 500nm 进行比色测定,求得样品中的含糖量。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。蔗糖酶活力单位(u) : 蔗糖酶在室温(50℃), 的条件下, 每分钟水解产生 1μmol 葡萄糖所需的酶量(ml) 。蔗糖酶比活力的计算: 酶的比活力——为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数,一般用酶活力单位/mg 蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度,对于同一种酶来说,比活力越大,酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力,是表示酶的纯度高低的一个重要指标。比活力——酶的总活力单位数除以总蛋白 mg数,即每 mg蛋白所含有的酶活力单位数。比活力=活力单位/mg 蛋白三、实验材料与试剂 1、实验材料蔗糖酶样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 2、实验试剂① 3,5 -二硝基水杨酸试剂; 甲液:溶解 结晶酚于 10 %NaOH 溶液中,并用水稀释至 69ml, 在此溶液中加 亚硫酸氢钠。乙液:称取 255 克酒石酸钾钠加到 300ml 10%NaOH 溶液中,再加入 800ml 1%3,5- ,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置 7-10 天以后使用。② 1g/L 葡萄糖标准溶液(葡萄糖相对分子量 ); ③ 5%蔗糖溶液; ④ 乙酸缓冲液, ; 四、实验器材与仪器 1、恒温水浴( 25 ℃、100 ℃); 2、可见光分光光度计、 1cm 玻璃比色皿; 3、试管、试管架; 4、移液管; 5、微量移液器: 200 μμl l、 1000 μμl l; ; 五、实验操作方法和步骤(一) 蔗糖酶活力的测定 1、标准曲线的制作按下表加操作: 以还原糖( mg数)为横坐标, A 520值为纵坐标,制作葡萄糖浓度-吸光值标准曲线。 0 葡萄糖(umol/L) 将各管溶液混匀后,在 100 ℃恒温水浴加热 5分钟, 取出立即用冷水冷却至室温 7777777 H 2O(ml)将各管溶液混匀 A 520 -二硝基水杨酸 (ml) H 2O (ml)