文档介绍：核酸的提取、纯化和电泳检测摘要质粒是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子,分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中,但在细菌细胞中含量最多。提取和纯化质粒DNA的方法很多,目前常用的有:碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-***化铯密度梯度离心法等等,其中碱变性法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的,,并通过RNase消化及酚-***仿抽提除去质粒DNA溶液中的RNA以及RNase等一些可溶性蛋白,最后获得纯度较高的质粒DNA。细菌基因组DNA呈环状裸露于拟核区,本实验中细菌染色体DNA的提取采用试剂盒的方式。本实验的目的在于掌握碱变性法提取质粒DNA及染色体DNA提取的原理、各种试剂的作用和方法,掌握DNA的纯化方法,即用RNase消化RNA以及用酚、***仿抽提法除去质粒中的蛋白质,学****并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化及纯度检测的实验原理,凝胶的制备及电泳方法及相应的方法操作。——缩短化学试剂作用时间,以减少其对核酸的损失;物理损伤——动作轻柔以减少机械剪切力;尽量低温操作以减少高温损伤;生物降解——加入相应酶抑制剂,防止生物降解排除其他分子的污染蛋白质——苯酚/***仿/蛋白酶KRNA污染——RNase其他DNA——区别变性与复性有机溶剂——萃取、乙醇沉淀与洗涤金属离子——(防止核酸酶的作用)破碎抽提核酸(裂解细胞释放容物)——关键步骤核酸的纯化除去杂质(蛋白质、脂类、核酸)4°C最佳和最简单;-70°C是长期保存的良好温度,为一次性保存;-20°C核酸样品的保存(主要条件时温度和介质)-TE缓冲液最常用质粒DNA的提取及纯化——碱变性提取法(碱裂解/变性法)RNase消化及酚-*** 质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子,分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中,但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1~200Kb之间,是应用最多的质粒类群,在细菌细胞它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。 提取和纯化质粒DNA的方法很多,目前常用的有:碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-***化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中,碱变性提取法最为经典和常用,适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单,易于操作,一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高,可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-***化铯密度梯度离心法,主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒,具有纯度高、步骤少、方法稳定,且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点,但提取成本高,需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等,沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA,但不影响限制性核酸切酶的消化、亚克隆及连接反应等。 在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验选择碱裂解法提取质粒DNA。 提取原则:①尽量保持核酸的完整性,即保持天然状态,防止核酸酶对核酸的降解(生物损伤),也要防止化学因素(酸、碱等)或物理因素(高温、机械剪切等)引起核酸变性或破坏。②最大限度减少染色体DNA的污染,去除RNA、可溶性蛋白质杂质。 碱裂解/碱变性法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,是基于染色体DNA(线性DNA)与质粒DNA(超螺旋DNA)的变性与复性的条件差异而达到分离目的。质粒DNA 具特定的形态结构,在特殊的环境条件下,如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰***试剂等会导致质粒DNA变性,去除变性条件又可以使DNA复性。碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在细菌细胞中,染色体DNA以双螺旋结构存在,质粒DNA以共价闭合环状形式存在。SDS是一种阴离子表面活性剂,它既能裂解细菌细胞,又能使细菌蛋白质变性。SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂,从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来,但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性;共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭