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分分子子克克隆隆技技术术
实验操作手册 2005
生命科学技术学院
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课程简介
分子克隆技术是指 DNA 的无性繁殖技术。分子克隆技术课程主要是针对生物技术
专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实
验课。实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧,主要包括分子克隆和分
子杂交两大部分:
分子克隆技术:DNA 重组技术是分子生物学的核心内容。本实验利用质粒载体克
隆外源 DNA 片段,通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源 DNA 的准备、
酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。
分子杂交技术:实验室常用的分子杂交技术主要有 Southern blotting,Northern
blotting,Western blotting 及 Dot blotting 等。Southern blotting 是通过用一种或多种限制
性内切酶消化基因组或其它来源的 DNA,经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的
片段,随后 DNA 在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上(硝酸纤维素膜或尼
龙膜)。DNA 转移至固相支持物的过程中各 DNA 的相对位置保持不变,用一定方法(如
放射性同位素)标记的 DNA 探针与固着在膜上的 DNA 杂交,经 X-光片自显影显现出与
探针 DNA 互补的 DNA 电泳条带的位置,然后进行分析。本实验要求掌握植物总 DNA
的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA 的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、
同位素操作等方面的实验技术。在转录水平上研究和了解基因的表达与调控是分子生物
学和基因操作的重要内容。为让学生初步了解有关 RNA 的操作过程注意事项,我们还
列出 Northern blotting 的操作步骤以供选择。
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目录
系列一分子克隆技术.....................................................................................................4
实验一质粒的制备......................................................................................................4
实验二 DNA 的琼脂糖凝胶电泳........................................................................5
实验三外源 DNA 片段在质粒载体中的克隆..........................................6
实验四感受态细胞的制备.....................................................................................9
CaCl2 感受态细胞的制备实验步骤.......................................................................................9
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤................................................................10
实验五质粒的转化及转化子的鉴定.............................................................11
热激法转化实验步骤:........................................................................................................11
质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤........................................................................12
实验六 PCR 技术..................................