文档介绍：实验二基因的PCR扩增技术一、 实验目的1、 学****PCR反应的基本原理与实验技术2、 从BCG基因组DNA+PCR扩增Rvl791(PE19)基因二、 基本原理1、 PCR类似于DNA的天然复制过程。2、 将待扩增的DN***段与其两侧互补的两段寡核甘酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增倍数可达/倍。3、 DNA的变性和复性1) 加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。2) 解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。三、 实验材料BCG基因组DNA❖10'PCR反应缓冲液、4'dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、引物(Pl、P2)、超纯水SWPCR反应管、移液器、PCR仪、离心机四、 实验步骤❖引物设计❖准备PCR反应溶液•PCR扩增反应❖结果检测❖Rvl791-F:ATGAATTCAGGAAGACAGCATGTCGTTC(EcoRT)•Rvl791-R:•TTCAG•(Xhol)(二)(lOnM),使溶液混匀I在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底(三)PCR扩增反应在PCR仪中设计如下反应程序:94°C>5min;94°C、30sec,61°C、40sec,72°C、30sec,30个循环;72。C、5ini >将已混匀的PCR反应管置于PCR仪的反应孔中,盖好一► 进行反应。反应完毕,将样品取出置于冰浴中待用(四)结果检测❖本PCR扩增的产物DN***段长度为300bp,%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。从每个反应管中取5ulPCR产物进行电泳检测。五、实验结果与分析20001000750500250100M 41M:DL2000DNAMarker/bp41:PCR扩增Rvl791(PE19)基因本组实验序号为41号。Rvl791(PE19)基因的分子量在250bp-500bp之间,符合已知数据DNA分子量是300bp,PCR扩增成功。本组实验PCR扩增的DNA量较少,可能原因有实验一时提取的DNA含量较少,DNA未与PCR反应溶液混合均匀。六、思考题•影响PCR结果的因素。解::不同PCR仪品牌与型号在温度控制性能上的不同直接影响了三种温度平台的温度的准确性和不均一性,因而影响了整个PCR反应的实验结果。另外,升温速度的不同,温度下降梯度的不均一性,温度过低,温度过冲,也是重要的因素。最差的情况,一个本该阳性的结果却可能得出阴性的结果。对于实时PCR,荧光信号输出和产量/溶解曲线,直接与温度控制有关系,而这些结果很可能是戏剧性的。PCR仪器之间的差别对实验结果的影响:没有任何两台PCR仪器的温度控制是一模一样的。相对于预设的温度模块温度总是偏高或偏低,就是同一模块不同的孔之间,温度有时也会不一样,相差