文档介绍：总RNA的提取(Trizol法提取)在收集到生物材料之后,最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存,则应以液氮将生物材料急速冷冻后,储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时,将储存于冷冻柜的材料取出,立即以加入液氮研磨的方式打破细胞,不可以先行解冻,以避免RNase的作用。提取组织RNA时,每50~100mg组织用1mlTrizol试剂对组织进行裂解;提取细胞RNA时,先离心沉淀细胞,每5-10╳106个细胞加1mlTrizol后,反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞;将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟;在上述EP管中,,盖上EP管盖子,在手中用力震荡15秒,在室温下(15℃~30℃)放置2~3分钟后,12000g(2℃~8℃)离心15分钟;取上层水相置于新EP管中,,在室温下(15℃~30℃)放置10分钟,12000g(2℃~8℃)离心10分钟;弃上清,按照每1mlTRIZOL加1ml75%乙醇进行洗涤,涡旋混合,7500g(2℃~8℃)离心5分钟,弃上清;让沉淀的RNA在室温下自然干燥;用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。PCR实验室常用DNA聚合酶有三种:TaKaRaTaqTM,TaKaRaEXTaqTM和PyrobestTMDNAPolymerase。TaKaRaTaqTM是一般的DNA聚合酶,保真性较差,但价钱便宜,一般用于基因表达的检测等。TaKaRaEXTaqTM是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶,具有一定的保真性,而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基,如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTMDNAPolymerase也是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶,其特点是保真性极高,扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。按下列组成在PCR反应管中调制反应液:TaKaRaTaqTM或TaKaRaEXTaqTM的配方ReagentQuantity,for50µlofreactionmixture10XPCRbuffer(Mg2+free)5µlMgCl2(25mM)如TaKaRaTaqTM加3µl如TaKaRaEXTaqTM加4µµl10µMPrimer上游1µl10µMPrimer下游1µlTemplateDNA1µµlSteriledeionizedwaterUpto50µlTotal50µl/SamplePyrobestTMDNAPolymerase的配方ReagentQuantity,for50µlofreactionmixture10XPyrobestbuffer5µµl10µMPrimer上游1µl10µMPrimer下游1µlTemplateDNA1µµlSteriledeionizedwaterUpto50µlTotal50µl/Sample反应总体积根据实际情况进行调控,可以做20~50µl以节约试剂;;如果不用PCR仪的加热盖,在反应混合液的上层加30~50µl的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发;按以下程序进行PCR扩增。PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异,在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进行优化。StepTemperature,°CTime,minNumberofcyclesNote起始变性94~951-3(5)1变性94~-225-35退火温度比理论退火温度大概低5°C,再根据反应结果优化退火37--2延伸70-75根据扩增产物的大小()每分钟延伸1000bp最终延伸70-75101保存4反应结束后,抽取扩增样品5µl,用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果,用DNAmarker判断扩增片段的大小或冷冻保存,以备以后分析使用。RT-PCRProtocol:TaKaRaOneStepRNAPCRKit(AMV)按下列组成在PCR反应管中调制反应液ReagentQuantity,for50µlofreactionmixture10×OneStepRNAPCRBuffer5µl25mMMgCl210µl10mMdNTPmix5µlRNaseInhibitor(40U/µl)1µlAMV-OptimizedTaq1µlAMVRTaseXL(5U/µl)1µl上游特异Primer(