文档介绍：EPSP(5-烯醇式***酰莽草酸-3-磷酸,5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate)合成酶基因(aroA,)克隆、定点突变1PCR引物所有引物由中能***公司负责合成:(1) sroA基因的PCR引物Primer1(上链):5'・TGACG-3'Primer2(下链):5'・GTTGAGCTCTCAGGCTGCTTG-3'(2) aroA突变G・A引物Primer3(上链):5'・GCAACGGCAACGCGTCO3'Primer4(下链):59-GAGGA-3?:每升含胰蛋白10g,酵母提取物5g,,灭菌后待用。%琼脂配成固体培养基。3实验仪器SIGMA冷冻离心机,高压灭菌锅,ZF紫外透射分析仪,凝胶电泳成像仪,屯泳仪,水平板屯泳槽及梳子,PCR仪,%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)20mg/nil蛋白酶K5mol/LNaCl溶液CTAB/NaCl溶液24:1***仿/异戊醇25:24:1酚/***仿/异戊醇异内醇70%乙醇步骤1•培养5m1的细菌培养物至饱和状态,,用吸管反复捶打使之重悬。加入30ul10%的SDS和3u120mg/ml的蛋白酶K,混匀,于37°C温育lh。加入100u15mol/LNaCl,充分混匀,再加入80u1CTAB/NaCl溶液,混匀,于65°C温育lOmino加入等体积的***仿异戊醇,混匀,离心4mino将上清液转入一个新管中。加入等休积的酚/***仿/异戊醇,混匀,离心5min,将上清转入一只新管屮。•醇,轻轻混合直到DNA沉淀下来,离心去上清,用70%乙醇屮洗涤。离心5min,弃上清,自然干燥,重溶于30u1的TE缓冲液。:(1):(25mM)3u1dNTP(10mM)(lOpmol/P1)lu1primer2(lOpmol/P1)lu1模板基因组2u1Taq酶(5U/u1)lu130u1石蜡油30u1反应程序为:94°C4min94°°C90s72°C120s72°C10min34个循环PCR产物经电泳鉴定并kit纯化。%,置于小三角瓶屮,加入100ml 1xTAE稀释缓冲液,微波炉加热至琼脂糖完全熔化,取出三角瓶,轻轻摇匀;2・用胶带将凝胶槽缺口封住,置工作台而上,将梳子安放在槽的凹槽内;小心地将胶液倒入凝胶槽内,使Z缓慢地展开直至形成约3mni厚的胶层,静置20分钟;待琼脂糖凝胶液凝固后,双手均匀用力轻轻拔出梳子;取下封边胶带,将凝胶连同槽放入电泳槽平台,,分别加入胶板的加样孔内。加样。,另一•端连接正极,接通电源,开始电泳。观察和拍照。小心地取出凝胶槽,