文档介绍：生物化学技术原理及应用第八章基因重组与基因分析2020/7/14南京农业大学生命科学学院22020/7/142南京农业大学生命科学学院核酸的分离纯化检测1DNA的体外合成2核酸序列测定3分子杂交4基因重组与表达5第一节核酸的分离纯化检测核酸是遗传信息的携带者,是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究,首先需要对核酸进行分离和纯化,核酸样品质量将直接关系到实验的成败。核酸包括DNA、RNA两种分子,在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在,要纯化核酸就必须去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子,去除其他不需要的核酸分子,同时要保持所要提取核酸分子的结构和活性不被破坏。核酸的性质:DNA为白色类似石棉样的纤维状物,RNA的纯品呈白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、***仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离酸易溶于水,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。2020/7/、纯化原则保持核酸分子一级结构的完整性意义:遗传信息全部储存在一级结构之中,核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。分离核酸原则:温度不要过高;控制一定的pH值范围(pH值5-9);保持一定的离子强度;减少物理因素对核酸降解的机械剪切力。2020/7/、纯化原则保持防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌,提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。DNA酶抑制剂金属离子螯合剂:DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活,因此使用金属二价离子螯合剂,可抑制DNA酶活性。如EDTA、8-羟基喹啉;阴离于型表面活性剂:如SDS,该试剂除对核酸酶有抑制作用外,还能使蛋白质变性,并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物,该复合物在高盐溶液中沉淀。2020/7/145南京农业大学生命科学学院保持防止核酸的生物降解RNA酶抑制剂。RNAase分布广泛,极易污染样品,而且耐高温、耐酸、耐碱,不宜失活。皂土。皂土带负电荷,能吸附RNase,使其失活。DEPC(二乙基焦碳酸盐)。粘性液体,强核酸酶抑制剂作用机制:与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意:DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100~1000倍。容易降解,保存在4℃或液氮中;提RNA时,%DEPC浸泡器皿37℃2h。剧毒。其它:肝素、复合硅酸盐、RNase阻抑蛋白、氧钒核糖核苷复合物。2020/7/:裂解细胞。去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子,去除其他不需要的核酸分子,如提取DNA分子时,应去除RNA,反之亦然。浓缩沉淀核酸。纯化核酸,去除盐类,有机剂等杂质。检测纯度与质量。核酸的保存保存。2020/7/:高速组织捣碎机捣碎;玻璃匀浆器匀浆;超声波处理法;液氮研磨法;化学处理法(SDS、LDS,吐温80等);生化法(溶菌酶、纤维素酶等)。该过程要在低温下进行,并避免核酸酶对核酸的水解。核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开,同时避免核酸降解。核蛋白有核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白两种,针对所提核酸的种类,要选择合适的方法。2020/7/14南京农业大学生命科学学院8核蛋白的解聚、变性蛋白的去除常用方法:加入浓盐溶液(如NaCl)。核酸-蛋白质加入NaCl后,破坏静电吸力,使氢键破坏,核蛋白解聚;***化钠溶液提取RNP,而选用1mol/L的***化钠溶液提取DNP。加入SDS。SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外,还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能;酚/***仿抽提。酚/***仿混合使用能增加去除蛋白的效果,并对核酸酶有抑制作用。***仿比重大,能加速有机相与水相分层,减少残留在水相中的酚,同时***仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。可加上一定量的异戊醇可防止起泡和促使水相与有机相的分离(酚:***:异戊醉=25:24:1)。2020/7//LNaClRNP溶解度大溶解度小DNP溶解度小(仅为水中1%)溶解度大(比在水中大2倍)核酸的沉淀浓缩核酸和蛋白质分离后,经离心后溶液分