文档介绍：中文摘要摘要病原微生物的流行对人类健康构成了重大威胁,研究病原微生物与宿主相互作用的分子基础,对预防与治疗感染性疾病、改善人类健康具有重要意义,它也一直是医学界面临的重要课题之一。生物信息学作为一门新兴学科己广泛地渗透到生命科学的各个研究领域,发挥着巨大作用。随着越来越多的全基因组序列的测定完成,对基因组序列进行比较分析,探索序列结构与病原微生物致病能力间关系的比较基因组学也应运而生,为病原微生物学的研究注入了新的活力。在前期研究中,我们应用生物信息学技术预测发现了一个新的蛋白家族(F1) proteins),分析表明该蛋白家族可能参与细菌与宿主相互作用,并且可能是具有 III型分泌系统的致病菌的重要效应蛋白(毒力蛋白)。肠出血性大肠杆菌(Enterohemo玎11agicE∞疗,E胍C)0157:H7是常见的肠道致病菌,感染该菌可引起腹泻、出血性结肠炎,溶血性尿毒综合征及血栓形成性血小板减少性紫癜等严重并发症,严重者可导致死亡,致死率达5%~10%。1982 年,融ley等报道了由0157:H7引起的出血性结肠炎的暴发流行,这也是把 0157:H7确认为严重致病菌的首次报道。随后在加拿大、日本、英国、澳大利亚等地发生了多起该菌的感染流行。1999年,在我国安徽、江苏两省曾暴发流行 0157感染性腹泻,患者超过2万人,死亡177人,流行时间7个月,可能是迄今为止世界上流行规模最大的一次。我国己将EHEC列为2l世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。由于0157:H7的感染呈现暴发流行趋势,感染后对人体有强烈的致病性与致死性,而且抗生素治疗可能会加剧病情, 因此,它已经成为全球性的公共卫生问题。0157培养容易、传播途径多样,感染性很强,<100CFU(菌落形成单位)即可致病,且多数病症较为严重。它也被美国疾病控制中心(CDC)列为B类生物恐怖病原体严加防范。通过近三十多年的研究,我们对0157:H7的致病机制已经有了初步认识,但尚未完全阐明,了解感染的致病机理对预防和治疗由该菌引起的流行性疾病具有重要的理论指导意义。我们应用生物信息学技术预测发现的新蛋白家族( proteins)成员中存在Z3672蛋白,它是一个来源于0157:H7的假想蛋白,根据预测信息我们推测它很可能是具有III型分泌系统的致病菌重要的效应蛋白(毒力蛋白)。因此,通过对0157:H7Z3672蛋白的研究,有望发现一个新的Ⅲ型分泌系统效应分子,从而推进0157:H7致病的分子基础研究工作,。本研究通过Red重组系统成功构建了0157:H7刀672缺失突变株。首先经过 PCR、酶切、连接等步骤,构建了两端同源序列分别约500bp的z36刀基因长同中文摘要源臂打靶片段,该片段连接在pET-24a载体上。然后通过pKoBEG质粒介导的 Red重组,使电击转化入菌体内部的同源臂打靶片段与0157:H7基因组序列进行了同源重组,经过抗性筛选、PCR鉴定以及测序分析,成功获得了0157:H7刀672 缺失突变体。,针对刀6刀基因在野生株是否转录进行了检测,比较0157:H7野生株与0157:H7刀672缺失突变株中刀672基因的转录差异,并且证明了在0157:H7野生株中刀672基因存在转录活性。在获得了0157:H7z3672缺失突变株后,主要对刀672基因的功能进行了初步研究。一方面,利用双向电泳以及蛋白质谱鉴定的方法,对0157:H7野生株和0157:H7刀6刀缺失突变株进行了蛋白质组学分析。研究表明,在0157:H7 z3672缺失突变株中,外膜蛋白A(OnlpA)的表达量升高。'ime PCR实验从基因的转录水平对以上实验结果进行了验证。结果证明,’inle PCR与双向电泳结果一致,因此,在0157:H7中,刀672基因与D,州(外膜蛋白A)基因存在某种联系,敲除z36力基因可以提高外膜蛋白A的表达水平。另一方面,通过体外细胞实验,比较0157:H7野生株与0157:H7 z3672缺失突变株对真核细胞(HeLa)造成的~它损伤是否存在差异。利用细胞骨架蛋白的免疫荧光实验,观察 0157:H7野生株与0157:H7力6刀缺失突变株分别粘附HeLa细胞后,细胞骨架蛋白Ac雠,Ke枷n,1、lbulin改变差异。实验表明,敲除Z3672基因前后,0157:H7 对细胞骨架蛋白Ac伽,Ke瑚畸n,Tubulin改变差异并不明显。这也说明,Z3672 蛋白不是0157:H7中影响真核细胞骨架改变的核心因子。在细胞骨架肌动蛋白荧光染色实验中发现:利用含lO%FBS的DMEM培养的