文档介绍：蛋白质亚基分子量测定SDS-PAGE凝胶电泳一目的掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量的基本原理和操作方法二原理SDS是一种阴离子去污剂,作为变性剂和助溶性试剂,能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白质分子的二级、三级结构;而强还原剂,如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此,在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后,蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链,解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后,形成带负电的蛋白质-SDS胶束,所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量,消除了不同分子间的电荷差异;同时,蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同,这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。基于上述SDS-PAGE的原理介绍,我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定;以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率,制作标准校正曲线,然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳,测定迁移率,从标准曲线得到相应的分子量三试剂和器材试剂:1低分子量标准蛋白质2待测蛋白质样品(用上次测定的可溶性蛋白样液)3凝胶贮液:30g丙烯酰胺,,溶于100ml蒸馏水中,过滤,于4°暗处贮存,一个月内使用41mol/l,-HCl缓冲液:Tris121g溶于蒸馏水,,以蒸馏水定容至1000ml510%(w/v)SDS610%(w/v)过硫酸铵溶液(当天配)7四甲基乙二胺(TEMED):,,SDS10g,溶于蒸馏水并定容至1000ml,使用时稀释10倍。92×样品稀释液:SDS500mg,巯基乙醇1ml,甘油3ml,溴酚蓝4mg,1mol/LTris-HCL(),用蒸馏水溶解并定容至10ml,按每份1ml分装,可在4℃存放数周,或在-20℃保存数月。以此液制备样品时,样品若为液体,则加入与阳平等体积的原液混合即可。10固定液:500ml乙醇,100ml冰醋酸,用蒸馏水定容至1000ml11脱色液:250ml乙醇,80ml冰醋酸,用蒸馏水定容至1000ml12染色液:-250溶解在250ml脱色液中器材:微量进样针,电泳仪,电泳槽四操作步骤1分离胶制备:凝胶浓度5%%10%%15%-%%(μL)20将上述胶液配好,混匀后,迅速加入两块玻璃板间隙中,使胶液面与矮玻璃和高玻璃之间形成凹槽处处平齐,而后插入“加样梳”,在室温下放置1小时左右,分离胶即可完全凝集。凝聚后,慢慢取出“加样梳”,取出时应防止把加样孔弄破,取出“加样梳”后,在形成的加样孔中加入蒸馏水,冲洗未凝集的丙烯酰胺,倒出加样孔中的蒸馏水后,在加入已稀释的电极缓冲液。2,样品制备:标准蛋白质制备待测蛋白样品制备:液体待测样品,可取500μL,加入等体积的“2×样品稀释液”,混匀,在沸水浴中加热5min,取出,冷却至室温备用。若液体待测样品蛋白质浓度太稀可经浓缩后再制备。3,点样用微