文档介绍：蛋白质含量测定法本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下:CH2COOH|+3H2SO4®2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)NH22NH3+H2SO4®(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4+2NaOH®2H2O+Na2SO4+2NH3(3)反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,。五种蛋白质测定方法比较如下:方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法(Kjedahl法)灵敏度低,~,误差为±2%费时8~10小时将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定非蛋白氮(可用三***乙酸沉淀蛋白质而分离)用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少;费时太长双缩脲法(Biuret法)灵敏度低1~20mg中速20~30分钟多肽键+碱性Cu2+®紫色络合物硫酸铵;Tris缓冲液;某些氨基酸用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏50~100mg快速5~10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶;各种核苷酸用于层析柱流出液的检测;核酸的吸收可以校正Folin-酚试剂法(Lowry法)灵敏度高~5mg慢速40~60分钟双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵;Tris缓冲液;甘氨酸;各种硫醇耗费时间长;操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高1~5mg快速5~15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其lmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液;TritonX-100;SDS最好的方法;干扰物质少;颜色稳定;颜色深浅随不同蛋白质变化二、双缩脲法(Biuret法)(一)实