文档介绍：第卷第期北京化工大学学报自然科学版.,.
矩
顶头孢霉基因的表达及抗体制备的研究
程,作。李强王文雅‘袁其朋
.北京化工大学生命科学与技术学院,北京;.清华大学化学工程系,北京
摘要:通过方法得到带酶切位点的基因,用于构建表达质粒一,并在大肠杆菌里成功表达出乙
酰转移酶的包涵体。将该重组蛋白的标准品作为抗原,免疫/小鼠得到多克隆抗体,酶联免疫吸附测定
分析得抗体的效价满足实验需求。利用该抗体绘制出抗原浓度的标准曲线,确定待测抗原适合的检测浓
度在. /以下。制得的抗体在重组大肠杆菌里检测到了乙酰转移酶,证明所得抗体具有实验价值。
关键词:顶头孢霉;;多克隆抗体;酶联免疫吸附测定
中图分类号:;;.
引言实验部分
头孢菌素类抗生素是一类重要抗感染药物,具. 实验材料
有无毒、抗酸、耐青霉素酶等优点¨。它们的生产.,天根生化;.,
原料头孢菌素是顶头孢霉属的代谢产物。盖宁生物;,本实验室保存。
生物合成的最后一步是由脱乙酰头孢菌素限制性核酸内切酶、连接酶、
经乙酰转移酶催化变成,由于在菌体内乙酰聚合酶等,公司; 聚合酶,赛百
转移酶自身表达量太低,这个过程是合成的限盛公司生产。
速步骤。国内针对乙酰转移酶及其编码基因——标记的羊抗鼠,北京天坛生物技术有
的研究刚刚开始,陈丹等成功克隆基因限公司;实验用/小白鼠,北京实验动物中
并在原核表达体系中表达出乙酰转移酶。心;福氏佐剂,公司;引物,北京北京三博远志
由于乙酰转移酶在微生物体内表达量较少,目生物有限责任公司合成,测序工作由北京六合华大
前的乙酰转移酶的体外检测方法——体外催基因科技股份有限公司完成。
. 原核表达质粒的构建和鉴定
化,检测生成物效果并不理想。且这种方
以原核表达质粒作为载体,构建顶头
法成本高,操作繁琐且灵敏度很低。酶联免疫吸附
孢霉乙酰转移酶原核表达质粒。在
测定是一种利用抗体与抗原的特异性结合
上找到来源于产黄顶头孢
作用来选择性识别和测定的微量检测技术,自
霉的基因序列,设计上游引物为:
年报道以来,以其规模化、集成化、高灵敏度达
.下划线部分是添加
到/水平等优势,正逐步被应用到生物大分
的酶切位点,下游引物为:
子等的痕量检测中。
下划
本文在大肠杆菌里表达乙酰转移酶,并免疫得
线部分是添加的Ⅲ酶切位点。扩增条
到抗体,通过酶联免疫吸附测定法检验所得的抗体
件为:℃变性,℃,℃,℃
满足实验要求。
,个循环;【结束扩增。用限制性核酸
内切酶和双酶切产物和
收稿日期:——
基金项目:国家“”计划质粒。连接酶℃连接后,产物转
第一作者:男,年生,,用筛选阳性克隆
通讯联系人并测序。
—: ..
北京化工大学学报自然科学版
. 重组质粒的诱导表达. 重组大肠杆菌中乙酰转移酶的测定

菌株,将测序后的质粒转入其中,经过筛选出加入诱导,从加入诱导剂时开始计时并取样
阳性菌落,提质粒酶切验证。将转化菌株接种于,,到后停止取样。
液体培养基,℃下培养至㈣, 取样品不经处理,在㈣下测菌体浓度,剩下
加入诱导剂进行诱导培养,收集菌