文档介绍：?卵巢回收时间和温度?卵母细胞采集方法?卵泡大小?卵丘细胞包被?卵母细胞体外成熟的调节机制卵巢回收时间和温度?卵母细胞停留体外时间对成熟影响很大。卵巢回收时间越短越好,最好是离体 2h 内将卵巢取回实验室。研究发现,母猪卵巢离体时间长短影响到体外成熟。与其他哺乳动物相比,猪卵子对温度特别敏感, 卵巢的回收温度较高或较低,卵母细胞体外成熟培养效果极差甚至是退化,较合适的回收温度是到达实验室时维持在 32~35 ℃当卵巢回收温度低于 25 ℃, 猪的卵母细胞将受到冷休克的打击。卵母细胞采集方法卵母细胞的采集方法有抽吸法和切剖法。在从离体卵巢上采集卵母细胞时,因采集方法不同,所得卵母细胞体外成熟率间存在一定的差异,如抽吸法成熟率( % )低于切剖法( % )。抽吸法和切剖法相比两者各有优缺点。与抽吸法相比,切剖法虽然费时,但极少破坏卵丘卵母细胞复合体( COCs ),这种采集方法更有利于 COCs 的生长发育(陈晓宇等, 2002 )。注射器抽取有腔卵泡要比用刀片割破所取卵母细胞的数目要少,但是符合取卵时间愈短愈好的原则,因其方便、干净、简捷而被普遍使用。但要注意选择合适的注射器和针头。通常 10mL 注射器加 18 号针头是比较合适的。实践发现 10mL 注射器实用操作性比 5 和 20mL 的好,抽取卵泡的速度也比较快,特别是针头的大小非常重要。针头太大,卵母细胞流失很多,没有足够数量的卵母细胞进行实验;针头太小则抽取过程中卵丘细胞会大量的脱落, 因为卵丘细胞对卵母细胞有重要的协同作用,卵丘细胞的脱落将不利于卵母细胞的体外成熟。卵泡大小不同卵巢上的卵泡大小不一样,同一卵巢上的卵泡大小也不同。一般取直径为 3~6mm 的为宜,其质量较好,卵丘细胞形态好的较多,整体大小比较均匀,核成熟率为 % 。哺乳动物大腔卵泡的卵母细胞、小腔卵泡的卵母细胞和原始卵泡都能完成体外成熟和体外受精,但卵泡的大小对卵母细胞的成熟和发育有重要影响。猪卵泡直径直接影响卵母细胞体外成熟率,成熟率较高的卵母细胞是来自中等直径的卵泡,而小卵泡中的卵母细胞成熟率明显下降。来自大卵泡的卵母细胞在体外培养时退化严重(王海, 2002 )。孟庆刚等( 2001 ) 研究了由 2mm 以下猪卵泡获得的小、中、大三类卵母细胞, 培养 48h 的成熟率分别为 0、 % 和 % 。 2mm 以下卵泡卵母细胞的成熟率( % )显著低于 2~6mm 卵泡卵母细胞的成熟率( % )猪卵泡直径只有达到 2mm 以上, 其卵母细胞才具备体外成熟的能力,小腔卵泡中的卵母细胞缺乏进一步发育所需的关系因子,大卵泡中卵母细胞的退化可能与其过早成熟而发生老化有关。卵母细胞的分级?包裹在卵母细胞周围的卵丘细胞的层数也影响着卵母细胞的体外成熟。不同的研究者对卵母细胞的分类不尽一致。根据卵母细胞外卵丘细胞的有无和层数,猪卵丘-卵母细胞复合体分 5级[5] 。A级:扩展且颜色较暗,卵丘细胞有 5 层以上包裹的胞质均匀的卵母细胞; B级:卵丘细胞颜色较浅且稀疏的,卵丘细胞有 5层以上包裹的胞质均匀的卵母细胞; C级:有 3~5层卵丘细胞紧密包裹的均匀胞质卵母细胞; D级:卵丘细胞稀少,胞质不均匀; E级:裸卵、黑卵。 A、B级可以用于体外成熟培养,一般成熟率较高, 而C、D级则效果较差, E级不能用于体外培养。卵丘细胞包被卵丘细胞质量是影响卵母细胞体外成熟的重要因素之一。卵母细胞所需的营养物质依赖卵丘细胞提供,两者间还通过缝隙连接进行信号传导,进而调节卵母细胞的生长和成熟。裸卵仅能够利用周围介质中的丙酮酸和三羧酸循环的中间产物,不能直接利用葡萄糖。卵丘细胞可将葡萄糖转化为丙酮酸,为卵母细胞的生长和发育提供能量。如果两者间缝隙连接被过早破坏, 卵母细胞可能停止发育(郑行, 1994 )。卵丘细胞在卵母细胞离体后至受精前的成熟培养期间里对卵母细胞自身的成熟起着很大作用,从而影响到随后的受精及卵裂过程,而这个作用是随着卵丘细胞层数的增加而提高(杨膺白等, 1994 )。 FSH 、 LH 通过作用于卵丘细胞上的受体,传递信号或分泌活性物质,作用于卵母细胞,调节卵母细胞发育( Byskov 等, 1997 )。说明卵丘细胞包裹对于卵母细胞体外成熟有积极作用。在卵母细胞的体外成熟过程中,卵母细胞成熟率和成熟的质量,取决于卵丘细胞的数量和质量。在卵母细胞体外成熟研究中,一般根据卵丘细胞的数量和扩张的程度分为 4 种类型:即包绕 3 层以上紧密卵丘细胞的卵母细胞为第 1 类; 3 层以下的为第 2 类;卵丘细胞扩展而疏松,卵母细胞卵质无斑块的为第 3 类;无卵丘细胞的卵母细胞(裸卵) 为第 4 类。李丽立等( 2002 )对这 4