文档介绍：8免疫学实验实验一、外周血单个核细胞的分离单个核细胞:、基本原理?常用哪些方法分离细胞,免疫学可采用哪些方法本实验是利用不同的细胞之间密度不同的性质,通过速度沉降法来分离制备外周血中单个核细胞操作:1、稀释血:1m血+1m缓冲液(含5~10U/ml肝素的PBS,无血清)(用滴管)2、加于淋巴细胞分离液上层,离心:500g20mn(小于1000m)!沿管壁滴加淋巴细胞分离液取法离心单个核细胞(斜面!)3、吸出细胞,悬于营养缓冲液(1~2倍量含5U/m肝素、2%灭活小牛血清的PBS液),离心:200g10min,除去血小板。4、洗涤:同样营养液洗涤2次,洗去淋巴细胞分离液,离心:500g10mn5、检查细胞存活率(1)将1滴细胞悬液和1滴台盼兰混匀,静置5-10分钟(2)上述混合液滴入细胞计数板,在显微镜下观察细胞,计数活细胞数和死细胞数。、注意事项1。血液制品2。注意将稀释后的血轻轻地沿管壁铺在细胞分离液上,避免破坏其界面。3。在收集单个核细胞时,预先将毛细滴管中的气体排空,再将毛细滴管轻轻插入单个核细胞层,沿管壁轻轻旋转吸取细胞,千万不能吹打,以免影响细胞的收集效果4。抽血后在2小时内使用。*关于实验报告:全部内容都要填写,关于日期。报告你的细胞收率,存活率。实验二、酶联免疫检测技术(ELISA)、实验原理酶联免疫测定法实质上是将专一性很强的、十分灵敏的、能够定量进行的抗原抗体结合反应与高催化效能的酶促反应偶联在一起的一种分析方法。它除了用来测定抗体外,原则上适用于一切可以诱导动物产生相应抗体的抗原和半抗原物质的测定。其特点是专一性强,灵敏度高,操作简便,无须特殊设备,特别适用于测定成分复杂的体液及组织中的微量生命物质,而且几乎不受其他物质的干扰。、原理(续)测定方法酶联免疫测定法应用非常广泛。具体操作方法随测定对象及测定要求的不同而有很大差异液相固相吸附测定法——酶联免疫吸附测定法(ELSA)简称酶标法酶标法的基本测定方法有三类即间接法(抗原-抗体-酶标抗抗体)双抗体(夹心)法(抗体-抗原-酶标抗体)抗原竞争法。本次实验检测血清lgG,应用的是双抗体夹心法ELISAddantigenAddenzyme-Addsubstrate(S)coatedwellconjugatedandmeasureseconaaryantibody实验方法:、包被抗体包被抗体浓度为:用包被液稀释(包被聚苯乙烯要在偏碱性条件下进行,)抗体至10或20ug/m,每孔加100u。加18孔18孔的安排:ELISA荧光免疫套上包装袋,4°C过夜,弃上清,以洗涤液(200u)空标准:S1-S5阴阳洗涤三次,甩自对对照照关于对照、平行!!!2、加抗原!!!稀释抗原用加BSA的保温液稀释!!!如上页图所示,加抗原,空白和荧光阴性对照加含BSA的保温液标准抗原1-5的浓度分别为50,100,200,300,500ng/ml都从500ngm加,分别加10,20,40,60,100u至各孔,再分别补加90,80,60,40,Ou保温液即可)荧光各孔:阴性对照:Ab-Ag-FITC-Ab,阳性对照用200ng/ml,500ng/ml37℃C,1hr,洗涤液洗涤三次