文档介绍：TUNEL检测方法——DeadEnd??Colorimetric?TUNELSystem试剂盒法检测原理:细胞凋亡时,其DNA会产生3′-OH末端,而正常细胞则几乎没有。使用末端脱氧核苷转移酶(TdT酶)将生物素标记的核苷酸连接到DNA的3′-OH末端。再将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin?HRP)结合在此核苷酸上。Streptavidin?HRP可与过氧化物酶的底物——过氧化氢和稳定的显色剂氨基联苯***(DAB)产生深棕色反应。即可通过光学显微镜观察到凋亡细胞。材料试剂盒(G7130)内容:名称量说明平衡缓冲液生物素标记的核苷酸混合物40μl2×20μlTdT酶40μl2×20μlStreptavidin?HRP40μlmlDAB20XChromogen200μlDABSubstrate20XBuffer200μlHydrogenPeroxide20X200μlSSC,overslips40(2×20)储存条件:?平衡缓冲液,?TdT酶,?生物素标记的核苷酸混合物,蛋白酶K?:–20°CStreptavidin?HRP,?DAB?20X?Chromogen,?20X?DAB底物缓冲液,20X过氧化氢:?4°C20X?SSC,塑料盖玻片:室温保存需自备:PBS?缓冲液%过氧化氢溶液(用以抑制内源性过氧化氢酶?)固定液(例如:10%缓冲的福尔马林,4%多聚甲醛,4%无甲醇甲醛)?封固剂用于组织的检测方法由试剂盒内容制备:20μg/ml蛋白酶K工作液:10mg蛋白酶K+1ml蛋白酶K缓冲液r→10mg/ml蛋白酶K储备液→20μg/ml蛋白酶K工作液TdT酶反应液(使用时制备):缓冲液成分每标准100ul反应的成分体积反应次数(实验反应+选择性阳性对照)成分的体积平衡缓冲液98ul×?=生物素化的核苷混合物1ul×=rTdT酶1ul?×?=?2XSSC:用去离子水1:10稀释20X?SSCStreptavidin?HRP工作液:以PBS500:1稀释Streptavidin?(使用时制备,避光,<30mins):950ul去离子水+50ul?20X?DAB底物缓冲液+50ul?DAB?20X?色原体+50ul?20X过氧化氢步骤:%***化钠溶液浸洗5mins(室温)PBS浸洗5mins(室温)4%多聚甲醛溶液或含10%福尔马林的PBS溶液中固定15?mins(室温)PBS浸洗二次,每次5?mins(室温)除去多余液体,滴加100μL20μg/ml蛋白酶K工作液,覆盖组织。置于平面,孵育10--30mins(室温)。染色缸内PBS浸洗5mins。(室温)4%多聚甲醛溶液或含10%福尔马林的PBS溶液固定5?mins。(室温)PBS浸洗二次,每次5?mins。(室温)除去多余液体,滴加100μL平衡缓冲液,覆盖组织。置于平面,平衡5~10mins(室温)。置于冰上,除去多余液体,添加100μLTdT酶反应液,防止干燥。37℃,湿盒中孵育60min,(以使末端标记反应发生)。(过程中应防止干燥)。染色缸内2XSSC浸洗15mins(用于终止反应)。(室温)PBS浸洗三次,每次5min,(用于移去未结合的生物素标记的核苷酸)。(室温)%过氧化氢的PBS中浸洗3-5min(用以抑制内源性过氧化氢酶)。(室温)PBS浸洗三次,