文档介绍：WesternBlot问题指南时间:-05-1308:55起源:网络作者:admin点击:3679次依据问题类型关键分成以下几类(以下资料权作参考,请勿盲目模拟!);?解答:《抗体技术试验指南》和Antibodies(alaboratorymanual,依据问题类型关键分成以下几类(以下资料权作参考,请勿盲目模拟!);?解答:《抗体技术试验指南》和Antibodies(alaboratorymanual,wrotebyEdHarlow,davidlane)两本书不错。(以下简写成WesternBlot),提取线粒体后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用博士德一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120μg,换了个santacloz一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗?解答:怀疑是样品问题,可能是:1,样品不能反复冻融;2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时,提议检验WesternBlot过程,提升一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,通常加PMSF就能够了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。?解答:当然能够,有甚至能够同时测几十种样品。,操作需要注意什么?解答:假如是膜蛋白和胞浆蛋白,所用去垢剂就要温和得多,这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶活性。E我样品蛋白含量很低,每微升不到1微克,不过在转膜时常常会发觉只有一部分蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发觉有孔全部蛋白条带全部在,只是颜色变淡了,有什么措施能够处理?解答:你能够加大上样量,没有问题,还有转移时你能够用降低电流延长时间,多加5-10%甲醇。,SDS-PAGE电泳分离胶浓度多大适宜?积层胶浓度又该用多少?这么大分子量蛋白轻易作WesternBlot吗?解答:260kd蛋白不好做,分离胶用6%,%。,要用什么方法来增加上样量?假如需要加大上样量使原来弱条带能看清楚。解答:能够浓缩样品,也能够依据你目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。通常地,超载30%是不会有问题。假如已经超了不少了,而且小分子量也要,能够考虑加大胶厚度,。?解答:-80℃,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。,%,但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采取11%配方,不知为何?解答:上述您提到两种凝胶均能够使用,因为105KD蛋白在上述两种胶线性分辨范围内,但需注意条带位置。,二抗是生物素化多克隆抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采取这么方案后,封闭液是否要作调整,能否再用5%脱脂奶粉呢?仿佛有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素生成,是吗?解答:不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,,通常一次上样蛋白总量是多少,跟目标蛋白表示量相关系吗?解答:WesternBlot通常上样30-100微克不等,结果跟目标蛋白丰度、上样量、一二抗量和抚育时间全部相关系,也和显色时间长短相关。开始摸条件时,为了拿到阳性结果,各个步骤全部能够量多一点时间长一点,当然背景也就出来了。要拿到好结果,假如抗体好话比较轻易,抗体不好话就需要反复地试了,当然有不适合WesternBlot怎样做也不行。所以拿到好结果不轻易。,处理样品有什么诀窍吗?还有,您用过大牛血清做封闭剂吗?浓度怎样?效果是不是比BSA好一点?解答:必需进行研磨、匀浆、超声处理,蛋白质溶解度会更好,离心要充足,膜蛋白需用更猛烈方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶活性(加入PMSF和蛋白酶抑制剂cocktail),封闭剂通常5%脱脂奶粉较常见。假如一抗为多克隆抗体,使用BSA也是不错选择。,在做western要注意什么呢?解答:做200kd蛋白WesternBlot时要注意,分离胶最好选择>7%;剥胶时要小心;转移时间需要对应延长;要做分子量参考(不然出现杂带不知道怎样分析)。?解答:能够浓缩样品;增大上样体积来增大上样量。,膜蛋白提取可不能够不用到超速离心机,有没有直接用低温高速离心机就能够提到膜蛋白方法,42kd蛋