文档介绍：试验一、菌株复壮和单菌落菌株获取一、试验目标学习细菌培养LB培养基及抗生素抗性筛选培养基配制,掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基础试验操作技能。二、试验材料、设备及试剂1、试验材料大肠杆菌()DH5α菌株:R-,M-,Amp-2、试验设备恒温摇床,电热恒温培养箱,无菌工作台,高压灭菌锅3、试剂酵母浸膏,蛋白胨,氯化钠,琼脂,卡那霉素三、试验步骤液体LB(Luria-Bertain)培养基配方:蛋白胨(typtone) %(1g/100ml)酵母提取物(Yeastextraction) %()氯化钠 %(1g/100ml) 固体LB培养基:,预防药品相互污染!每组按上述液体LB培养基配方,以配制100ml量称取药品放入烧杯。用量筒量取约80ml蒸馏水注入烧杯中,玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容至100ml。pH试纸检测pH值,。将100ml溶液分装入两个三角瓶,每瓶为50ml。按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中,以配制成两瓶50ml固体LB培养基。两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标识。把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中,盖上锅盖,以对称方法拧紧锅盖,打开排气阀通电加热,至有连续白色水蒸气从排气阀排出时,关闭排气阀。当高压锅温度(气压)指示器指示锅内温度升高至121℃()时,调整电压(或利用手动开关电源方法)使高压锅稳定在该温度(压力)下20min,然后断开电源。待指示器指示压力降为0时,方可打开排气阀,然后再打开锅盖小心取出锅内物品。取出三角瓶后,在酒精灯火焰旁进行下述操作。取其中一瓶直接倒培养皿,每皿倒入量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄一层即可。每组倒1块培养皿,在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组标识。另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时(刚能感觉不烫手),(Amp)溶液,使培养基中Amp终浓度为50mg/L。快速充足混匀后每组倒1块培养皿,在皿盖上标注“LB+”及各组标识。接种环蘸取菌液,密密划线。倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。一天后观察菌落。四、思索题在说明本试验所用菌种时用到这么符号:“R-,M-,Amp-”,这告诉我们相关该菌种什么信息?在步骤7中,为何须待连续白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀?当灭菌完成,为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅,而且操作次序必需是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖?在步骤12中,为何需将涂有菌培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌培养?为何不是正放呢?你估计该试验结果是什么,即两种培养基上菌生长情况怎样?试验二碱裂解法小量提取质粒DNA一试验目标了解少许质粒制备方法和原理,掌握碱法小量提取质粒DNA操作步骤。二试验原理本试验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来,所以称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜,但更关键作用在于其和钾离子反应后所引发溶液中绝大部分蛋白质和基因组DNA共沉淀。因为还有很多蛋白质不能被共沉淀掉,所以要深入用酚、氯仿对溶液进行抽提。。从细菌中分离质粒DNA方法关键包含3个基础步骤:培养细菌使质粒扩增;搜集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。(100μl,1000μl),台式高速离心机五试剂溶液Ⅰ:50mmol/L葡萄糖,25mmol/(),10mmol/LEDTA()。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。溶液Ⅱ:、1%SDS(%SDS母液稀释)。溶液Ⅲ:5mol/LKAc60ml,,,定容至100ml,并高压灭菌。溶液终浓度为:K+3mol/L,Acˉ5mol/L饱和酚、氯仿、,5000rpm5min搜集菌体;,将管倒置于吸水纸上尽可能使液体流尽; 3. 菌体沉淀重悬浮于200μl溶液Ⅰ中;Ⅱ,加入新配制溶液Ⅱ200μl,盖紧管口,快速温和上下颠倒eppendorf管数次以混匀溶液(千万不要振荡,动作轻柔);Ⅲ,盖紧管口并温和颠倒离心管数次,混匀溶液