文档介绍：肝糖原提取、判定和定量一、,了解其注意事项。、糖原和葡萄糖判定和蒽***比色测定糖原含量原理和注意事项,掌握其操作方法。。(视具体情况,采取适宜混匀方法)。。。二、试验原理(一)肝糖原提取、判定糖原储存于细胞内,采取研磨匀浆等方法可使细胞破碎,低浓度三***醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保留于上清液中,从而使用糖原和蛋白质等其它成份分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀,再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后展现颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖还原性,可判定肝组织中糖原存在。CuSO4十2NaOH═Na2SO4+Cu(OH)2↓2Cu(OH)2十C6H12O6═2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O2CuOH═Cu2O↓(红色)+H2OCu(OH)2═CuO↓(黑色)+H2O(二)肝糖原定量糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖深入脱水生成糠醛衍生物—5-羟***呋喃甲醛,此化合物再和蒽***脱水缩合生成蓝色化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10-100μg范围内,溶液颜色深浅和可溶性糖含量成正比。利用此反应和一样处理已知葡萄糖含量标准溶液比色,经过标准对照法(直接比较法)即可计算出样品中糖原含量。糖原在浓碱溶液中很稳定,故在显色之前,肝组织先置于浓碱中加热,以破坏其它成份,而保留肝糖原。三、材料和方法:以步骤图示意试验材料:(一),室温~100℃恒温水浴箱(×2),分光光度计,精度为10mg级电子天平(×1)(×1),镊子(×1),研钵(×1)(×1),(100×15)mm试管(×3)(2mL×1,5mL×2),1000μL微量可调取液器(×1)(×1)(×1)(二)。%乙醇。(5%)三***醋酸溶液。。。(50%)NaOH。。。(30%)KOH溶液。(50mg/L)。(90%)H2SO4(用于制备蒽***显色剂)。***显色剂:称取蒽***,用17mol/LH2SO4溶解至100mL。此试剂不稳定,以当日配制为宜,冰箱保留可用4-5d。试验方法:吸收1mL量溶液时使用可调微量取液器,吸收1mL以上量溶液时使用刻度吸量管。肝糖原提取和判定操作步骤以下:,剪碎+l3COOH1ml研磨至乳状+l3COOH3ml研磨成肝匀浆全部转入离心管中,离心3分钟(4000r/min)沉淀(弃去)上清(取2ml)+2ml95%乙醇,混匀,静置10分钟离心5分钟(4000r/min)上清(弃去)沉淀+蒸镏水1ml沸水浴2分钟,溶解沉淀白瓷板孔穴中糖原溶液1ml+浓HCl5滴加碘试剂2滴加碘试剂2滴沸水浴15分钟,冷却糖原溶液2滴+50%NaOH