文档介绍：菌种保留方法微生物含有轻易变异特征,所以,在保藏过程中,必需使微生物代谢处于最不活跃或相对静止状态,才能在一定时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低关键原因,所以,菌种保藏方法虽多,但全部是依据这三个原因而设计。保藏方法大致可分为以下多个: 、穿刺培养、疱肉培养基培养等(后者作保藏厌氧细菌用),培养后于4—6℃冰箱内保留。 ,能够合适延长保藏时间,它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌液体石蜡,首先可预防因培养基水分蒸发而引发菌种死亡,其次可阻止氧气进入,以减弱代谢作用。 ,如土壤、沙子、硅胶、滤纸上,以后进行干燥保藏法,比如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 ,如病毒、立克次氏体、螺旋体等,它们必需在生活动物、昆虫、鸡胚内感染并传代,此法相当于通常微生物传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其它方法如液氮保藏法和冷冻干燥保藏法进行保藏。 (-20—-30℃,-50—-80℃)、干冰酒精快速冻结(约-70℃)和液氮(-196℃)等保藏法。 (-70℃左右)下快速冷冻,然后在减压下利用升华现象除去水分(真空干燥)。有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液,以预防因冷冻或水分不停升华对细胞损害。保护性溶质可经过氢和离子键对水和细胞所产生亲和力来稳定细胞成份构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。三、器材细菌、酵母菌,放线菌和霉菌; 肉膏蛋白胨斜面培养基,灭菌脱脂牛乳,灭菌水,化学纯液体石蜡,甘油,五氧化二磷,河沙,瘦黄土或红土,冰块、食盐,干冰,95%酒精,10%盐酸,无水***化钙; 灭菌吸管,灭菌滴管,灭菌培养皿,管形安瓿管,泪滴形安瓿管(长颈球形底),40目和100目筛子,油纸,滤纸条(×),干燥器,真空泵,真空压力表,喷灯,L形五通管,冰箱,低温冰箱(-30℃),液氮冷冻保藏器。四、操作步骤、各保藏法应用范围及优缺点下列各法可依据试验室具体条件和需要选做。 ,待菌充足生长后,棉塞部分用油纸包扎好,移至2—8℃冰箱中保藏。保藏时间依微生物种类而有不一样,霉菌、放线菌及有芽孢细菌保留2—4个月,移种一次。酵母菌两个月,细菌最好每个月移种一次。此法为试验室和工厂菌种室常见保藏法,优点是操作简单,使用方便,不需特殊设备,能随时检验所保藏菌株是否死亡、变异和污染杂菌等。缺点是轻易变异,因为培养基物理、化学特征不是严格恒定,一再传代会使微生物代谢改变,而影响微生物性状;污染杂菌机会亦较多。 (1)将液体石蜡分装于三角烧瓶内,塞上棉塞,并用牛皮纸包扎,>,℃灭菌30分钟,然后放在40℃温箱中,使水汽蒸发掉,备用。(2)将需要保藏菌种,在最适宜斜面培养基中培养,使得到健壮菌体或孢子。(3)用灭菌吸管吸收灭菌液体石蜡,注入已长好菌斜面上,其用量以高出斜面顶端1cm为准(图Ⅶ-12),使菌种和空气隔绝。(4)将试管直立,置低温或室温下保留(有微生物在室温下比冰箱中保留时间还要长)。此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死,酵母菌可保藏1—2年,通常无芽孢细菌也可保藏1年左右,甚至用通常方法极难保藏脑膜炎球菌,在37℃温箱内,亦可保藏3个月之久。此法优点是制作简单,不需特殊设备,且不需常常移种。缺点是保留时必需直立放置,所占位置较大,同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后,接种环在火焰上烧灼时,培养物轻易和残留液体石蜡一起飞溅,应尤其注意。 (1)×,×8cm安瓿管中,每管1—2张,塞以棉塞,>,℃灭菌30分钟。(2)将需要保留菌种,在适宜斜面培养基上培养,使充足生长。(3)取灭菌脱脂牛乳1—2ml滴加在灭菌培养皿或试管内,取数环菌苔在牛乳内混匀,制成浓悬液。(4)用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内,使其吸饱,再放回至安瓿管中,塞上棉塞。(5)将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂干燥器中,用真空泵抽气至干。(6)将棉花塞入管内,用火焰按图Ⅶ-13熔封,保留于低温下。(7)需要使用菌种,复活培养时,可将安瓿管口在火焰上烧热,滴一滴冷水在烧热部位,使玻璃破裂,再用镊子敲掉口端玻璃,待安瓿管开启后,取出滤纸,放入液体培养基内,置温箱中培养。细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏,前二者可保藏2年左右,有些丝状真菌甚至可保藏14—