文档介绍：显微标本制作的一般原理及步骤
湖州师院杨建民
一、实验原理
显微标本的制作技术是组织学、胚胎学、生理学及细胞学等学科研究观察细胞、组织的生理及病理形态变化的一种主要方法。
大多数的生物材料,在自然状态下是不适合显微镜观察的,因为材料较厚,光线不易透过,以致不易看清其结构。细胞内的各个结构,由于其折射率相差很小,即使光线可透过,也难以辩明。
但在经过固定,脱水,透明,包埋等手续后就可把材料切成较薄的片子,再用不同的染色方法以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学成份含量的变化,就可以在显微镜下清楚地看到其中不同的区域组分状态。切片也便于保存,所以是教学和科研中常用的方法。
一、实验原理
生物显微制片方法
非切片法:涂片,铺片,压片,磨片,整装片
切片法:石蜡切片法,火棉胶切片法,冰冻切片法
显微制片技术虽是生物学中很基本的操作技术,但由于生物材料的个体差异,化学试剂的多样性,因此操作技术相当细致而复杂,方法也很多,每一步骤的失误都可导致整体的失败,因此需要耐心细致,不断总结经验,才能有所结果。
二、实验用品
1 器械
2 常用试剂
常用固定剂
常用脱水剂
常用透明剂
常用粘贴剂
包理剂
封固剂
常用染剂
1 器械
电温箱:体积较小,温度调节一般在60-75oc,用于融腊及滲腊
显微镜:用于观察染色情况,及检查切片效果
切片机:切片用。通常为了能够得到连续切片,多用转动切片机[图]
切片刀:为切片机必备配件[图]
磨刀机:磨刀用[图]
电热温台:为了展平蜡带或烤干制片[图]
天平:配溶液用
玻璃器皿:染色缸,烧杯,量桶,试剂瓶,移液管等
其它:剪子,镊子,解剖针,毛笔,刀片,小木块等
2 常用试剂- 常用固定剂
包音氏(Bouin`s)固定液
苦味酸饱和水溶液 75ml 甲醛(40%) 25ml 冰醋酸 5 ml
该液适用于固定无脊柱动物,其渗透力强,组织收缩小,不易变形。
海利氏(Helly`s)液
重铬酸钾 氯化汞 6 g 蒸馏水 100ml 40%甲醛液 5 ml
该液适用于骨髓,脾,肝等造血器官的固定。
卡诺(Carnoy)固定液
纯酒精 15 ml 冰醋酸 5 ml
该液渗透迅速,可用作植物组织或培养细胞的固定,亦适用于动物组织,但不易时间太长,防止组织过度硬化。
约翰森固定液
福尔马林 5 ml 丙酸 5 ml 酒精 90ml
该液用于固定植物根尖,茎尖,有较好的效果,通常固定24小时,亦可做保存液。
2 常用试剂
常用脱水剂:酒精,正丁醇,叔丁醇,丙酮等
常用透明剂:二甲苯,甲苯,氯仿,丁香油等。
常用粘贴剂
明胶粘贴剂
明胶 1g 蒸馏水 100ml 石碳酸 2g 甘油 15ml 蛋白粘贴剂
新鲜蛋清 25 ml 甘油 25 ml 石炭酸 g
包理剂:石蜡,火棉胶,明胶等。
封固剂:阿拉伯树胶,加拿大树胶。
常用染剂
代氏(Delafield`s) 苏木精
苏木精 4g 95%酒精 25ml 10%铵明矾水溶液 400ml
(上述试剂配好后,瓶口用纱布封盖,置向阳处,3-4天后加入下列试剂。)
甘油 100ml 甲醇 100ml
该液两月后成熟,色彩蓝紫色,时间越长效果越好,为生物制片技术中最常用的核染剂,染色后,% 盐酸水溶液褪去浮色,可使染色显出不同层次(此过程称为分色)。
伊红(Eosin)
伊红 -1g
水 100ml
伊红又称曙红,是酸性染料,一般与苏木精共同使用,(H,E染色)主要染细胞质,胶原纤维及肌纤维
番红-固绿对染
固绿染液: 95%酒精溶液; 番红染液: 1g番红溶于100ml 50%酒精溶液。
制备植物石蜡切片常用固绿--番红对染,结果是木质化的细胞壁及细胞核染成红色,薄的细胞壁(纤维素)和胞质染成绿色。
苏丹ш染液
苏丹ш - 70%酒精 100 ml
此染液主要用于染脂滴。
三、操作步骤
1 非切片法
非切片法即不用切片机、不经切片手续而制成切片的方法。根据材料性质的不同,有不同的处理方法。该类方法操作简单快捷。其中铺片法、封藏法可使原有组织结构不被破坏;涂片法、压片法弥补了用包埋、切片法有时观察不清楚的不足,因此是显微标本制备中常用的手段。