文档介绍：1荧光定量 PCR 技术及临床应用荧光定量 PCR 技术及临床应用三九集团第三军医大学基因诊断中心卫国 2 荧光基因探针杂交定量 PCR 技术介绍 1985 年美国 PE- cetus 公司的人类遗传研究室 mullis 等人发明了具有划时代意义的 PCR 技术,从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望成为现实。 1987 年该项技术获美国专利。 1988 年 PE- cetus 公司推出了第一台 PCR 热循环仪,从而使 PCR 技术的自动化成为现实。 Mullis 出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变的发明者 Michael 分享了 1993 年诺贝尔化学奖。随着 PCR 技术的日臻成熟 1995 年出现荧光基因探针杂交定量 PCR 方法 3传统的临床微生物检测方法传统的临床微生物检测方法细菌涂片细菌培养免疫学技术分别存在检出率低、周期长、特异性差的缺点。 4普通 PCR 临床检测技术的缺点普通 PCR 临床检测技术的缺点普通 PCR 临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题,但由于假阳性率高,不能正确指导临床实践。因此国家卫生部曾在 1997 年行文禁止将普通 PCR 技术用于临床诊断。 5 FQ-PCR 与普通 PCR 的区别采用闭管检测,不需 PCR 后处理,并采用 dUTP -UNG 酶的防污染系统,扩增和检测一次同时完成。不需开盖,不产生污染。避免了假阳性。探针与被检 DNA 序列特异杂交, 增强了特异性。 6 FQ-PCR 与普通 PCR 的区别可定量结果,准确灵敏地反应了病原体的感染和治疗恢复情况。光谱分析仪直读结果,自动分析, 增强了灵敏性和客观性。 7荧光基因探针杂交定量 PCR 技术随着 PCR 技术的日臻成熟,已出现的荧光基因探针杂交定量 PCR 方法把目的基因扩增、特异分子杂交和荧光化学融为一体,使 PCR 扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行, 并通过微机控制,实现了对扩增产物进行实时动态检测和结果的自动分析。 8荧光基因探针杂交定量 PCR 技术不仅进一步提高了特异性,并从根本上解决了 PCR 扩增产物污染的难题,保持了 PCR 技术的快速和高灵敏性,使假阳性率和假阴性率降低到最低限度,而且能定量被检微生物的核酸拷贝数,为临床实践提供准确的病原微生物的诊断、提供评估药物临床治疗效果的可靠依据。因此,荧光基因探针杂交定量 PCR 技术诊断病原微生物与迄今本院各临床科室所进行的临床检测技术不相重复,它是一种属不同层次、快速、准确、直接并具有不同临床指导意义的检测方法。 9 荧光定量聚合酶链反应( FQ- PCRFluorescence quantitative PCR ) 一种完全闭管式的 PCR 和荧光探针杂交技术相结合的定量 PCR 方法 PCR 的高效扩增特性核酸探针的高特异性光谱技术的高灵敏性和可计量性 10荧光基因探针杂交定量 PCR 技术与临床荧光基因探针杂交定量 PCR 技术与临床在确保特异性的前题下,高质的灵敏性使得 PCR 技术能探测到疾病发展的初期阶段,甚至于临床症状出现前或亚临床状态或机体正在向病态发展的早期过程之中,如对于感染性疾病,以往的方法要么间接的检查机体免疫系统对侵入微生物的反应产物降解产物(如抗原)或直接检查侵入微生物(如培养,镜检),但上述方法的灵敏度都受到方法学上的限制而达不到检查极微量级(如 Pg 水平),因而难以在早期对疾病的发生做出准确,客观的诊断,但 PCR 巨大的放大效率却解决了这一问题。