文档介绍：分类号 Q75 学校代码 10129
U D C 577 学号 072100018
基于 Halo-Tag 技术的高通量药物筛选系统的研究
Research of Quantitative and High-throughput Screening System
based on Halo-Tag technology

申请人:赵亮
学科门类:理学
学科专业:生物化学与分子生物学
研究方向:蛋白质化学
指导教师:魏建民教授
林坚副教授

论文提交日期:二〇一一年五月
摘要

Halo-Tag 蛋白名为卤代烷脱卤素酶,是由微生物紫红红球菌的脱卤素酶演化而
来。该酶可把卤代烷烃中的卤素取代基去除,通过置换脱卤素酶活性中心的组氨酸,
使得烷基残基可以有效地以共价键形式结合于蛋白上。Halo-tag 蛋白可以非常高效地
通过共价键与的配体稳定结合,可以与磁珠或其它介质亲和吸附,用于纯化大肠杆菌
或哺乳动物细胞的蛋白。
此外,Halo-tag 也可以特异性地通过共价键与报告配体或固化配体结合,来对融
合蛋白进行荧光检测或固相吸附等试验操作。
依据 Halo-Tag 技术原理,以结核分枝杆菌脂肪酸合成酶(mtFabH),设计出一系
列带有 Halo-Tag 配基的 mtFabH 靶向小分子化合物,利用 Halo-Tag 和 Pull-Down 技
术验证靶向小分子化合物是否与 mtFabH 结合。结果表明:
1、酶切鉴定和测序以及蛋白表达纯化结果表明目的蛋白 mtFabH 成功插入原核
表达载体 pET-32a (+)中,得到浓度较高的纯重组蛋白 His-Trx-mtFabH。
2、酶切鉴定和测序以及蛋白表达纯化结果表明目的蛋白 Halo-Tag 成功插入原核
表达载体 pGEX-3X 中,得到浓度较高的纯重组蛋白 GST-Halo-Tag。
3、利用 His-Tag PULL-DOWN 实验,验证带有 Halo-Tag 配基的结核杆菌脂肪酸
合成酶(mFabH)的靶向小分子化合物与靶标蛋白的相互作用。实验结果与靶标化合
物的活性吻合。
根据以上实验结果证明 Halo Tag 技术可以应用在靶向药物的筛选研究。

关键词:Halo Tag 技术;mtFabH;基因重组;蛋白表达纯化;药物筛选
Research of Quantitative and High-throughput Screening System
based on Halo-Tag technology

Abstract
Halo-Tag Protein named Haloalkane dehalogenases,it is evolved dehalogenase of
us enzyme can remove the halogen substituents from the
haloalkanes,Through the replacement of dehalogenase’s activity center ,to make alkyl
residues can be formed covalent bond effectively with Halo-Tag Tag protein
can very efficiently and bined with ligands through covalent bond,affinity
adsorb with ic beads or other mediums for purification soluble protein from E. coli
or mammalian cells.
According to Halo-Tag technology,as model based on fatty acid synthase of
Mycobacterium tuberculosis,designed out serious mtFabH target small molecular
compounds with Halo-Tag Halo-Tag and Pull-Down technology to identify
and certify whether if pounds bin with mtFabH results
showed:
1、Restriction enzymes analy