文档介绍：(5)高通量测序：环境微生物群落多样性分析
微生物群落多样性基础概念
环境中微生物群落结构及多样性和微生物功效及代谢机理是微生物生态学研究热点。长久以来，因为受到技术限制，对微生物群落结构和多样性认识还不全方面，对微生物功效及代谢机理方面了解也极少。但伴随高通量测序、基因芯片等新技术不停更新，微生物分子生态学研究方法和研究路径也在不停改变。第二代高通量测序技术（尤其是Roche
454高通量测序技术）成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境改变而发生极其微弱改变，对于我们研究微生物和环境关系、环境治理和微生物资源利用和人类医疗健康有着关键理论和现实意义。
在中国，微生物多样性研究包含农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等很多领域。以在医疗领域应用为例，经过比较正常和疾病状态下或疾病不一样进程中人体微生物群落结构和功效改变，能够对正常人群和一些疾病患者体内微生物群体多样性进行比较分析，研究取得人体微生物群落改变同疾病之间关系；经过深度测序还能够快速地发觉和检测常见病原及新发传染病病原微生物。研究方法进展
环境微生物多样性研究方法很多，从中国外现在采取方法来看大致上包含以下四类：传统微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法和分子生物学方法等等。
近几年，伴随分子生物学发展，尤其是高通量测序技术研发及应用，为微生物分子生态学研究策略注入了新力量。
现在用于研究微生物多样性分子生物学技术关键包含:DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。DGGE等分子指纹图谱技术，在其试验结果中往往只含有数十条条带，只能反应出样品中少数优势菌信息；其次，因为分辨率误差，部分电泳条带中可能包含不只一个16S
rDNA序列，所以要得悉电泳图谱中具体菌种信息，还需对每一条带构建克隆文库，并筛选克隆进行测序，此试验操作相对繁琐；另外，采取这种方法无法对样品中微生物做到绝对定量。生物芯片是经过固定在芯片上探针来取得微生物多样性信息，“只能验证已知，却无法探索未知”，此方法经过信号强弱判定微生物丰度也不是很正确。
而多年来以454焦磷酸测序为代表高通量测序技术凭借低成本、高通量、步骤自动化优势为研究微生物群落结构提供了新技术平台。Roche
454高通量测序技术能同时对样品中优势物种、稀有物种及部分未知物种进行检测，取得样品中微生物群落组成，并将其含量进行数字化。最近，美吉生物推出了新测序平台———MiSeq。MiSeq高通量测序平台集中了Roche
454和Illumina HiSeq
2500优点，不仅可实现对多样品多个可变区同时测序，而且在测序速度和测序通量上全部有深入提升，现在此平台已在微生物多样性群落结构研究方面受到了广大学者认可。第二代高通量测序技术
产品优势
无需培养分离菌群：
直接从环境样本中扩增核糖体RNA
高变区进行测序，处理了大部分菌株不可培养难题。
客观还原菌群结构：
专业、成熟、稳定样本制备步骤，严格控制PCR
循环数，客观还原样品本身菌群结构及丰度百分比。
痕量菌检测：
充足发挥高通量测序大数据量优势，能检测出丰度低至万分之一痕量菌。生信分析
1. 稀释性曲线（Rarefaction Curve）采取对测序序列进行随机抽样方法，以抽到序列数和它们所能代表OTU数目构建曲线，即稀释性曲线。
当曲线趋于平坦时，说明测序数据量合理，更多数据量对发觉新OTU边际贡献很小；反之则表明继续测序还可能产生较多新OTU。
横轴：从某个样品中随机抽取测序条数；"Label "
表示该分析是基于OTU ，即相同度为97% 水平上进行运算，用户能够选择其它不一样相同度水平。
纵轴：基于该测序条数能构建OTU数量。
曲线解读：
? 图1中每条曲线代表一个样品，用不一样颜色标识；
?
随测序深度增加，被发觉OTU 数量增加。当曲线趋于平缓时表示此时测序数据量较为合理。
2. Shannon-Wiener
曲线
反应样品中微生物多样性指数，利用各样品测序量在不一样测序深度时微生物多样性指数构建曲线，以此反应各样本在不一样测序数量时微生物多样性。
当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，能够反应样品中绝大多数微生物物种信息。
横轴：从某个样品中随机抽取测序条数。
纵轴：Shannon-Wiener 指数，用来估算群落多样性高低。
Shannon 指数计算公式：
其中，
Sobs= 实际测量出OTU数目；
ni= 含有i 条序列OTU数