文档介绍：PCR 基因扩增一、实验目的?通过本实验学****PCR 反应的基本原理与实验技术二、实验原理? PCR 是一种由引物介导的选择性体外扩增 DNA 的方法,由美国人 于1983 年发明?包括三个基本步骤: ?变性( Denature ):目的双链 DNA 片段在 94℃下解链?退火( Anneal ):两种寡核苷酸引物在适当温度( 50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对?延伸( Extension ):在 Taq DNA 聚合酶合成 DNA 的最适温度下,以目的 DNA 为模板进行合成?由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的 DNA 扩增一倍,这些经合成产生的 DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经 25~35轮循环就可使 DNA 扩增达 10 6 倍 1、 PCR 反应中的主要成份?引物? dNTP ? Mg 2+ ?模板? Taq DNA 聚合酶?反应缓冲液引物? PCR 反应产物的特异性由一对上下游引物所决定?引物设计和选择目的 DNA 序列区域时遵循下列原则: ?引物长度约为 16~30bp ?引物中 G+C 含量通常为 40% ~60% ,可按 Tm = 4(G+C)+2(A+T) 粗略估计引物的解链温度?四种碱基应随机分布,在 3’端不存在连续 3个G或C,因这样易导致错误引发?引物 3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对?在引物内,尤其在 3’端应不存在二级结构?两引物之间尤其在 3’端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量?引物 5’端对扩增特异性影响不大,可引入酶切位点或突变位点?引物不与模板结合位点以外的序列互补?简并引物应选用简并程度低的密码子?引物的浓度一般为 ~ μ mol/L ,引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增,引物浓度偏低则降低产量 dNTP ? dNTP 常用的浓度为 20~200 μ mol/ ,而且 4种 dNTP 的终浓度相等,以减少合成中由于某种 dNTP 的不足而出现的错误掺入? dNTP 浓度过高虽可加快反应速度,但会增加碱基的错误掺入率,同时会抑制 Taq DNA 聚合酶的反应活性;适当的低浓度会提高反应的精确度?注意协调 Mg 2+浓度和 dNTP 浓度之间的关系 Mg 2+ ? Mg 2+浓度会影响 Taq DNA 聚合酶的活性、真实性,影响引物退火、解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等?通常 Mg 2+浓度范围为 ~ 2mmol/L ?在 PCR 反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或 EDTA 等可能影响 Mg 2+浓度的物质,以保证最适 Mg 2+浓度模板? PCR 反应必须以 DNA 为模板进行扩增,单链分子、双链分子、线状分子或环状分子均可以作为模板 DNA (线状分子比环状分子的扩增效果稍好) ?模板的数量和纯度均会影响 PCR 结果:一般反应中的模板数量为 10 2~10 5 个拷贝。模板拷贝数过多可能会增加非特异性产物?模板 DNA 中的杂质也会影响 PCR 的效率 Taq DNA 聚合酶?早期 PCR 扩增是由大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段完成,但这种酶不耐热,所以每一轮循环在变性和退火后必须加入新酶?后来引入耐热的 Taq DNA 聚合酶,一般 Taq DNA 聚合酶活性半衰期为 ℃ 130min ,95℃ 40min ,97℃ 5min ,因此 PCR 中变性温度不宜超过 95 ℃? Taq DNA 聚合酶的最适温度是 72 ℃,连续保温 30min 仍具有相当的活性,一次加酶可满足 PCR 反应全过程的需要?纯化的 Taq DNA 聚合酶有 5’→3’外切酶活性,而无 3 ’→ 5’外切酶活性, 不具有 Klenow 酶的 3 ’→ 5’校对活性,因此在 PCR 中有错误掺入率,大约是每 2×10 4个核苷酸中有一个,在利用 PCR 克隆和进行序列分析时尤为注意? Taq DNA 聚合酶的酶活性单位定义为 74℃下, 30min 掺入 10nmol/L dNTP 到核酸中所需的酶量。在100 μL反应体系中, ~2U 的 Taq DNA 聚合酶就足以进行 30轮循环?使用 Taq DNA 聚合酶浓度过高,可引起非特异性产物的扩增,浓度过低则扩增产物量减少反应缓冲液?一般含 100mmol/L Tris · Cl(20℃下 - ) , 500mmol/L KCl 和0. 1 % 的明胶,有时候还有适当浓度的 Mg 2+ ? Tris · Cl是一种双极性离子缓冲液,主要靠其调节 pH ,使 Taq DNA 聚合酶