文档介绍：医学分子生学学
蛋自质的分离纯化
与定性定量分析
什么是蛋白质的分离纯化
令分离:将蛋白质混合物分成单一的蛋白成分。
◆纯化:得到单一蛋白的纯品。
为什么要纯化蛋白质?
◆研究特定蛋白质的生物学功能(酶、生物活性
蛋白,etc)
令制备抗体
◆蛋白质晶体学研究
◆研究蛋白质蛋白质相互作用
怎样纯化蛋白质?
◆生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差
异,来分离或纯化它。
◆可溶性、等电点、分子大小、生物学性质…
可溶性:硫酸铵沉淀
等电点:离子交换层析
分子大小:凝胶过滤层析
生物学性质:亲和层析
蛋百质纯化的基本设计原则
◆原料应易得到,并尽可能富含目的蛋白;
◆应有特异性的蛋白质检测方法(最重要的因素,
决定了纯化能否成功);
令分级分离,先粗后细;
◆纯化条件尽量温和,避免蛋白失活。
蛋白质的检测方法
◆蛋白质的活性检测方法:必须快,必须是特异
性的
◆蛋白质的免疫学检测方法: wester-blot,前提
是有特异的抗体
分离纯化的一般程序
(取决于采用的材料)
动物材料处理:剔除结缔组织和脂肪组织
种子处理:去种皮,有机溶剂脱脂
动物细胞破碎:匀浆器、超声波处理
植物组织:研磨,纤维素酶
细茵破碎:超声波,溶菌酶
◆如果蛋白质定位于某一细胞器,可用差速离心法
将其分离。
相对离心力/xg时间min
沉降的组分
1000
真核细胞
4000
叶绿体、细胞碎片
细胞核
15000
20
线粒体、细菌
30000
溶酶体、细菌细胞
碎片
100000
3-10h
核糖体
测
200×9
raction
( rough fractionation)
获得蛋白质提取液后,用一定方法,将蛋白质与
其它杂蛋白分离开来
常用方法:盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分
离等
特点:简便、处理量大、既能除去大量杂质(包
括脱盐),又能浓缩蛋白质溶液