文档介绍：补 充 2
酶催化活性的测定方法
目 的
掌握定时法和连续监测法测定酶活性的原理及方法
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一、测定酶促反应速度的两类方法
（一）酶促反应速度的表示方法
单位时间的底物的消耗量（-d[S]/min）
单位时间的产物的生成量（d[P]/min）来表示
（二）测定方法分类
定时法 在一定时间内通过测定总变化量再计算出速度.
连续监测法 直接用来测定速度
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（一）定时法
在足量的底物系统中，加入一定量的酶试剂，反应一定时间后，加入终止剂终止反应，然后测定底物的消耗量或产物的生成量
假设某一样品的酶活性为X（U/L），取样品量Vs毫升与底物缓冲液Vr毫升孵育，经过t分钟反应，加入终止液 Ve(ml)，检测到产物净吸光度增加为A，该产物的摩尔消光系数为 ε（终点法的摩尔消光系数一般可通过带标准求得）比色皿光径为b(cm)
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若把A/t以ΔA/min表示，则此定时法测定酶活性的计算公式与连续监测法相同
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定时法 是经过一定时间（固定的时间）反应后终止反应
终点法 指反应基本达到平衡，信号变化很小，但可以不需要终止反应
两点法 监测反应过程中的两个点，即某一段时间内的底物或产物的变化
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（二）连续监测法
连续监测法是将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，每隔一定时间（2-60s）连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号（如NADH在340nm的吸光度）的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率
一个典型的酶促反
应过程一般包括延滞
期、线性期和非线性期
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①对单一酶促反应而言，是指酶促反应从开始到达最大反应速度所需要的间，包括酶催化位点的暴露、底物解离后与酶结合位点的结合、酶与辅酶的结合、酶的激活等等
②对于酶偶联反应而言，延滞期还包括中间产物堆积到一定程后，导致指示反应速度增加，直到与待测酶酶促反应速度达到平衡所需的时间。一般来说，辅助酶越多，延滞期越长
是指酶促反应速度保持恒定的时期，不受底物浓度的影响。此期底物虽被不断消耗但还不足以明显改变酶促反应的速度，即以初速度进行
随着反应的进行，底物消耗越来越明显，反应速度明显下降而进入非线性期。酶浓度越高在选定条件下线性期就越短。其他造成进入非线性期的原因有可逆反应增强、产物抑制增加、酶变性失活增加、酶聚合或解离增加等等
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（二）连续监测法酶活性的结果计算
假设某一样品的酶活性为x（U/L），取样品量Vs与底物缓冲液Vr孵育，延滞期为t0分钟，测定间隔时间为t1分钟，读数次数为n，每间隔时间吸光度变化平均值为A，该产物的摩尔消光系数为ε比色皿光径为b（cm）。反应速度分别用产物的生成速度和样品中酶的催化能力来表示
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二、酶活性测定方法原理
（一）直接法
根据待测酶的酶促反应底物或产物有特征性的理化性质，然后通过特殊的仪器直接检测
NADH或NADPH在340nm处有特异吸收峰，而NAD+或NADP+只在260nm处有明显的吸收峰，监测340nm吸光度变化可以反应NADH或NADPH的变化。利用该原理可以测定以NAD（P）+或NAD（P）H为辅酶的氧化还原酶
例如LD、G-6-PD、α-HBD、AD、SD、GLDH等
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