文档介绍：郑州大学
硕士学位论文
纳米载体介导的hTERT反义寡核苷酸在体内外对EC9706细胞端粒
酶表达的影响
姓名:王瑾
申请学位级别:硕士
专业:病理学与病理生理学
指导教师:李惠翔;张振中
20070501
纳米载体介导的匆骞押塑账嵩谔迥谕舛细胞端粒酶表达的影响摘要研究生王瑾导师李惠翔张振巾郑州大学基础医学院病理学教研室河南省肿瘤病理重点实验室中国郑州复杂的渐进过程,而端粒酶的激活和端粒长度的稳定是细胞永生化和恶性转化改的蛄泻偷鞍字首槌傻奶厥饨峁梗杂诒;と旧濉⒎繧旧迦诤稀⒔组成,近年来大量研究发现端粒酶是细胞永牛化和肿瘤发生必不可少的、人体内最具肿瘤特异性和高表达的生物学标志。其中嵌肆C富钚缘谋泶利用反义核酸技术,人汉铣砂邢騢的反义寡核苷酸食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其发生发展是一个多冈素、多步骤、变巾重要的一环。端粒是位于真核细胞线性染色体末端、由高度保守的简单重复解是非常重要的。端粒酶是一种核蛋白,有只〉ノ怀煞郑杭慈端粒酶琱⒍肆C改孀B济琱投肆C赶喙氐鞍譏亚基,它几乎存在械亩裥灾琢鲋校琱的表达端粒酶活性相一致,是端粒酶活性的决定性凶素。因此,晌0邢蚨肆C缚拱┎呗缘睦硐氚械恪据报道,%的食管癌组织中可检测到端粒酶活性及其逆转录酶的表达。,,抑制表达和端粒酶活性,诱导肿瘤细胞凋ⅲ海悄壳敖兄琢龌蛑瘟频姆较蛑弧5俏淳奘蔚墓押擞K郑州大学届碗士毕业沦空纳米载体介导的匆骞牙廛账嵩谔迥谕舛訣赴肆C副泶锏挠跋
方法和材料:遁的基凶载体保护和携带,使其进入细胞内发挥作用是基因治疗的关键。研究者们利用各种不同的病毒或非病毒基因载体保护和携带,目前多聚阳粒等独特的优势,保护馐芎怂崦傅慕到獾耐保岣吡俗H拘剩琀益聚阳离子纳米载体,是近年来最有临床应用潜能的非病毒基因载体,可以分为线导向配体等,合成更复杂的头畔低常南妆ǖ繬:天冬酰氨酸,喊被宜幔琑:精氨酸嚯模梢杂胫琢鲂律9苁芴錍匾煨越岷希寡核苷酸擅赘春衔铮谔逋庾H臼彻馨┫赴内实验中疨/邢蚰擅赘春衔锏奈榷ㄐ院涂伞行裕F浒邢蛑琢龅琒,制备狿/擅赘春衔铮H綞℃、饱和湿度的细胞培养箱中常规培养。一ヌヅQG迮嘌空白对照组琌易被胞内核酸酶降解,作用效果较差。因此,寻找合离子载体以其稳定、易制各、易进行化学修饰及可以缩合肿有纬赡擅孜受到厂‘泛关注,这其中聚乙烯亚胺琍魑R恢中滦偷亩型琇头种蚉猵,甈街掷嘈停唤鲇薪锨康慕岷螼和粘附细胞的能力,而且可偶联具有靶向肿瘤细胞特ⅲ糜谔迥诨蛑瘟啤本实验中制备了线型一聚乙烯亚胺—/端粒酶逆转录酶匆制备了奘蔚腖—疉靶向纳米复合物,静脉注射入裸鼠体内,分别观察对细胞的浴⒌鞍妆泶锏挠跋欤酝佳橹ぬ治疗提供实验依据,为该新型纳米载体在食管癌治疗中的应用提供理论基础。杓苹ゲ苟腁,及一条义寡核苷酸胞。体外细胞实验方法食管癌细胞,用含%优质胎牛血清的—培养基,于实验分组:组:椋./QG迮嘌杭尤階溶液郑州犬学届硕士毕业论文纳米载体介导的匆骞牙廛账嵩谔迥谕舛訣赴朔嶝矫副硌〉挠跋
尾缘静脉给予姒—春衔锶芤分别配甈/春衔颪/.........四唑赫比色试验碝法觳釲—复合物转染后对肿瘤细胞的抑迥诙锸笛榉椒静脉给药试验组尾缘静脉给予刚疉复合物溶液瘤旁皮下注射疨/:一ヌヅQG迮嘌杭尤隤春衔溶液,在缪瓜氯⊙缬荆蝗远撼上裣低彻鄄斓缬窘峁治鯨—涸芰Α共聚焦显微镜检测细胞埘狿米复合物的摄入情况;制作用;免疫细胞化学技术检测细胞内端粒酶鞍椎谋泶铮灰徊椒≧检测的表达:流式细胞术獀—和双标法检测细胞凋/阈∈螅は伦⑸淙耸彻馨┫赴礒鄄焯迥谌耸彻馨异种移植瘤的生长。制备疞—疉复合物溶液,注射入裸鼠体内。『宥哉兆尾缘静脉给予疨/┪锓植际笛榉肿实验组瘤旁皮下给予疨—春衔锶芤实验组尾缘静脉给,⑸湟┪铮籼旄┮淮危持续给药两周后采取拉颈法统一处死;每觳舛鎏宕笮∫淮危舛街埽计算肿瘤体积,绘制生长曲线。体内药物分布实验组各组分别于给药后、∈焙蠖暇贝λ溃⒓取出肝、肾、肺和瘤体组织,制作冰冻切片,激光共聚焦扫描显微镜下观察各组织的药物分布情况。郊州:;焖妒勘弦德畚纳米载体介导的匆骞押塑账嵩谔迥谕舛訣赴肆C副泶锏挠跋—畂
:常规病理切片及染色,显微镜下观察病理形态学改变。免疫组织化学技术检测移植瘤内端粒酶鞍椎谋泶铩体内实验中,,疞,;阴性对照组和转染组细胞为阴性着色,胞浆和胞核着蓝色。,分别为.%和.%。透射电镜观察细胞