文档介绍：非放射性EMSA
EMSA是一个比较复杂试验技术,因为工作原因接触这个试验技术到现在也有三年多时间了,做了大约也有几百 次吧, 那倒理想试验结果同时也碰到了很多莫名问题和结果,到现在为止还有没有处理,找不到原因一个问题,呵呵!
EMSA试验技术作为一个经典DNA/protein,RNA/protein检测技术,不是很多简单试验技术能够替换!比如曾经在我们这个论坛 中有站友提到这么一个问题:
某企业激活-和转运检测试剂盒，监测是否激活NF-KB测试剂盒原理：
NF-κB未被激活时和IκB-α形成一个复合物，分布在细胞浆中。在炎症因子、生长因子或趋化因子等能够激活NF-κB刺激存在情况下，IκB-α 会在Ser32和Ser36被磷酸化，随即被泛素-蛋白酶体路径降解。NF-κB和IκB-α解聚后，其核定位序列被暴露，从而被转运到细胞核内促进 NF-κB依靠基因转录。经过免疫染色检测NF-κB关键亚基p65是否被转移到细胞核内，就能够判定NF--κB激活－核转 运检测试剂盒仅染色p65，不染色RelB、C-Rel、p50和p52。使用本试剂盒染色后NF-κB呈红色荧光， 测理论我做了这么回复(!):
这种理论上来讲可行,不过实际操作可能拿不到你想要得结果,原因很简单,凭染色来判定是 极难区分程度上差异,就比如做WB试验,经典还是化学发光方法,显色方法只能得到信号比较强蛋白,碰到信号比较弱蛋白就误差很大了, 第二点,并不是全部能进核蛋白全部有结合DNA能力,假如结合了那才是真正参与转录转炉银子, 有入核后却不能和DNA结合,只能等着被降解!
其实总体而言大家做试验时全部期望成功,不过EMSA试验技术独特征和复杂性决定了,要想做成功EMSA试验,拿到阳性结果可总结为一句话: 把握整体,注意细节!
我觉EMSA整体性包含6大点:探针制备(设计,合成,标识,纯化,退火);个人试验设计(时间剃度浓度查阅文件等);核蛋白制备;浓度测 定;EMSA操作;试验时竞争设计. 这六大点全部是会直接影响到EMSA试验成功是否! 中间就必需注意到这六大点细节,包含操作细节,在这点上,我倒是很佩服美国佬态度, 她们要求每一个细节操作,并养成一个试验****惯; 比如其中一点:她们培训我们在配置溶液时候只要是液体东西不管什么养成一个****惯就是摇一摇,因为有些溶液静止时间长了有效大颗粒可能下沉,要是直 接取会造成不均匀误差,到时候试验结果出了问题,极难推断操作错误地方,养成一个****惯即使是蒸馏水也摇一摇,呵呵,倒不是说这么夸张,但强调是一 个严格而良好试验****惯! 呵呵,言归正传,试验技术毕竟是一门动手性很强科学,理论还是和动手还是有一定差异, ,方便站友学****br/>另外,,只能等大家碰到问题,只要我有时间在线就尽力帮忙交流, 呵呵 ! 我做最多还是NFKB,另外还有AP-1,STAT3,STAT5,HIF等,期望能于大家交流.
介绍:
EMSA ( Electrophoretic Mobility S