文档介绍：SDS-PAGE聚丙烯酰***凝胶电泳
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主要内容
实验目的
实验原理
实验材料和试剂
实验步骤
结果处理
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实验目的
了解电泳实验原理
掌握电泳实验操作规程
用电泳方法测定蛋白分子量
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实验原理
最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964) 和Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH ), 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH ), 分离胶中含Tris-HCl(pH )。% 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的***离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随***离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。
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SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18Å，），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。
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SDS聚丙烯酰***凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰***的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰***形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰***交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰***～丙烯酰***” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰***凝胶大多按“双丙烯酰***～丙烯酰***”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。
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凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰***和双丙烯酰***绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰***所灌制凝胶的线性分离范围如下表：
丙烯酰***浓度（%）
线性分离范围（kD）
15
12～43
10
16～68

36～94

57～212
双丙烯酰***～丙烯酰***摩尔比为 1：29。
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实验材料和试剂
试剂
丙烯酰***和N, N’-亚甲双丙烯酰***
十二烷基硫酸钠（SDS）
用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液
TEMED(N,N,N’,N’-四***乙二***)
过硫酸铵
Tris-甘氨酸电泳缓冲液
样品处理液（50mM Tris-HCl(pH )，100mM DTT(or 5% 巯基乙醇)，2% SDS，% 溴酚蓝，10%甘油）
染色液（% 考马斯亮蓝 R250，40% 甲醇10% 冰醋酸）
脱色液（10% 甲醇，10% 冰醋酸）
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实验步骤
***凝胶所需的各种试
***凝胶的灌制
迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰***溶液,留出灌注浓缩胶所需空间()。再在胶液面上小心注入一层水（约2~3mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液；
分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水；
制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰***溶液，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。
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聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。
在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比加入样品处理液，在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。
浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。
按予定顺序加样，加样量通常为10～25μl（）。
将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。
从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝