文档介绍：基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
基因工程要素：包括外源DNA，载体分子，工具酶和受体细胞等
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基因工程基本操作过程
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（基因表达载体的构建）是基因工程的核心。
切、接、转、增、检
重组DNA技术的操作步骤：
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基因工程基本操作过程
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基因工程基本操作过程
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外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用.
基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基因．将两者连接起来，将目的基因插入于可以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以这种外源性的目的基因在受体细胞内得到扩增或正确表达。
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基因工程基本操作过程
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依不同的研究目的而定，认真设计最终构建的重组体分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是：
(1) 表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启动子、增强子等调节序列和终止序列，要将目的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审视“阅读框”是否正确，这些对表达融合蛋白至关重要。
(2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析，则需考虑选择适当的报告基因，并将可能具有调控机能的目的基因置于报告基因的上游适当位置。
若调控基因可能有增强子作用，还应在报告基因下游适当部位插入一个功能基因，由此反映增强子的作用。
一、连接前的准备
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基因工程基本操作过程
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基因工程基本操作过程
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为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，使其可以互相连接，形成新的重组分子。
二、连接前的处理
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基因工程基本操作过程
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载体DNA通常有着许多酶切位点．但是并不是所有的酶切位点都可用于重组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件:
1）位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA以最高的几率正确组合.
2） 在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。
3）选择的载体必须在连接后对基因转录和翻译过程中的编码区读框不改变。
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基因工程基本操作过程
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当载体和外源DNA用同样的限制性内切酶切割时，所形成的DNA末端就能够彼此相匹配，可以被T4连接酶共价地连接起来，形成重组体分子。 但是,当靶片段的末端与载体不匹配时，必须转换其中一个或两个片段的末端形式以便使之连接。这种末端的转换通常用以下三种方式转换：
① 3’凹端补平：使用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段部分补平3’凹端，将不匹配的3‘凹端转换为粘端；或者完全补平，产生平端DNA分子，可与任何其他平端DNA相连接。
② 3’突端切除：T4噬菌体DNA聚合酶具有强烈的3’- 5’外切核酸酶活性，可将3’突端切除。
③ 平端加上人工合成接头：合成接头是自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带一个或多个限制性酶切位点的平端双链体。因此在平端DNA加接头可为其亚克隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。
2、连接前的处理：末端的转换
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基因工程基本操作过程
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载体DNA和目的基因DNA的连接,按DNA片段末端性质不同，可有下述不同的连接方法：
① 粘性末端连接法
② 平端连接法
③ 同聚物加尾连接法
④ 人工接头连接法
三．基因与载体的连接 4种方法
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基因工程基本操作过程
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