文档介绍：MTT法目的和意义
检测细胞存活和生长情况
用于评价药物产生的细胞毒作用
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MTT法检测细胞活力讲解
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原理
四唑盐（噻唑蓝）是一种能接受氢原子的染料，简称MTT
活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二***亚砜（DMSO）能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。
在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数成正比。
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MTT法检测细胞活力讲解
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活细胞+MTT
琥珀酸脱
氢酶
紫蓝色结晶物 Formazan
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MTT法检测细胞活力讲解
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贴壁细胞操作步骤
1.  接种细胞：%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔2000-3000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积90 ul。 （边缘孔用PBS或空白培养基填充）。 2.  培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板，大约12h），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，每孔加药10 ul，一般设5个复孔。
3. 5%CO2，37℃孵育分别孵育24小时后，倒置显微镜下观察。
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MTT法检测细胞活力讲解
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4. 每孔加入10ul MTT溶液（5mg/ml，%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6. 每孔加入100ul二***亚砜（置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
（培养基、MTT、二***亚砜），对照孔（细胞、培养液、MTT、二***亚砜）
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MTT法检测细胞活力讲解
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悬浮细胞操作步骤：
1）将细胞离心收集后，调节细胞悬液浓度大约1×104/ml，每孔先加细胞悬液90ul,相应梯度的药物每孔10ul；共100ul加入到96孔板（边缘孔用PBS填充）。每板设对照。同时设置调零孔（培养基、MTT、二***亚砜），对照孔（细胞、培养液、MTT、二***亚砜），每组设5个复孔。
2）置37℃，5%CO2孵育24小时，倒置显微镜下观察。
3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，%MTT），继续培养4 h
4）每孔加三联裂解液（10gSDS，异丁醇5ml，10M HCl ）过夜， 第二天早晨置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm测量各孔的吸光值。
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MTT法检测细胞活力讲解
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药物的配制
浓度
体积
过滤
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MTT法检测细胞活力讲解
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MTT的配制
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性，用的时候小心,，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，因为时间较短。
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MTT法检测细胞活力讲解
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实验结果统计学处理
所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<，p<。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线曲线，专门公式求IC50（半数抑制浓度 ）。或计算抑制率。
OD对照组-OD实验组
抑制率 % =
OD对照组
×100 %
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MTT法检测细胞活力讲解
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实验结果统计学处理
公式如下：
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) Xm:lg 最大剂量 I:lg(最大剂量/相临剂量) P:阳性反应率之和 Pm:最大阳性反应率 Pn:最小阳性反应率
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