文档介绍：小鼠肝细胞原代培养实验目的: 1. 了解并掌握原代细胞培养的相关原理2. 了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法实验器材: 二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、 DMEM 培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、 %胰蛋白酶(含 % 胶原酶)、 D-Hanks 或者 PBS 等。小鼠肝细胞原代培养原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步,也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化,仍具有二倍体遗传物质,最接近和反映体内生长特性,很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。原代培养是获取细胞的主要手段,但原代培养的组织由多种成分组成, 比较复杂,即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞,细胞间也存在很大差异。如果供体不同,即使组织类型、部位相同,个体差别也可以在细胞上反映出来。因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定,如要做较为严格的对比性实验研究,还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行(需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化)。一般采用2-5代的细胞进行实验。当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。小鼠肝细胞原代培养原代培养的方法很多,最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法(消化法)。组织块原代培养: 组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法,适用于各种组织的原代培养,特别是难以消化的组织,组织块原代培养法操作程序简单, 培养前不经过酶液处理,细胞损伤较小。但由于培养过程中细胞移动受到较大限制,完成原代培养所需的时间较长。组织块培养的程序一般为:1. 组织块修整:将组织块用平衡缓冲液反复冲洗,然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm 3 。 2. 贴壁:将组织块间隔(小块之间的间隔为1 cm)放在培养皿中,培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。 3. 培养:通过生长繁殖,细胞可以从组织块边缘向四周游出,最终生长繁殖连成片,原组织块可以完全消失。小鼠肝细胞原代培养离散细胞原代培养: 动物细胞在体内有严密的组织结构,多数组织的形态是固体结构,细胞与细胞或者细胞与细胞间质之间联系紧密,要得到大量的离散细胞就必须进行人工分离(消化培养)。也有部分组织的细胞自然状态下就是松散的,从体内取出后不用处理(如血细胞)或稍加处理(如脾细胞)就可以得到细胞悬液。细胞离散后由于每个细胞都能与支持物接触,营养供应均匀,因此适应快、增殖快、建系快。通常的离散细胞原代培养步骤为:取材、剪切、消化、接种。原代培养的细胞往往在制备时含有很多细胞种类,这就需要对分离的细胞进行纯化,细胞纯化分为悬浮细胞纯化和贴壁细胞纯化。悬浮细胞纯化多使用密度梯度离心法和表面抗原法(需要固化的抗体, 如各种细胞分离柱)。贴壁细胞纯化通常是细胞贴壁法(依据贴壁的快慢)和酶消化法(依据贴壁的细胞对消化酶的敏感程度不同)。小鼠肝细胞原代培养肝脏是由肝细胞组成,肝细胞极小,肉眼看不到,必须通过显微镜才能看到。人肝约有25亿个肝细胞,50个肝细胞组成一个肝小叶,因此人肝的肝小叶总数约有50万个。