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上传人:mazhuangzi1 2020/12/23 文件大小:17 KB

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文档介绍

文档介绍:实验一 DNA的小量制备
小量法提取植物基因组DNA(CTA法)
1实验目的:
随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用,人们经常需要提取高 分子量的植物DNA用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等,这 是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定 DNA 的原理并掌握CTAB提取DNA的方法,进一步了解DNA的性质。
2实验原理
细胞中的DNA绝大多数以DNA蛋白复合物(DNP的形式存在于细胞核内。提取 DNA时,一般先破碎细胞释放出DNP再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质, 最后用
乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DNP与核糖核蛋白(RNP在不同浓度的电解质溶 液中溶解度差别很大,利用这一特性可将二者分离。以 NaCI溶液为例:RNP在
NaCI中溶解度很大,而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1%。当NaCI浓 度逐渐增大时,RN的溶解度变化不大,而DNP的溶解则随之不断增加。当NaCl浓 度大于1mol/L时,DNP勺溶解度最大,为纯水中溶解度的 2倍,因此通常可用
NaCl提取DNA为了得到纯的DNA制品,可用适量的RNase处理提取液, 以降解DNA中搀杂的RNA
关于植物总DNA的提取主要有两种方法:
CTAB法:
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵,hexadecyltrimethylammo nium bromide, 简称 CTAB:是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液 中( )是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度( mol/L NaCl) 时从溶液中沉淀,通过离心就可将 CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开, 然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中, 再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB 能溶解于乙醇中。
SDS 法:
利用高浓度的阴离子去垢剂SDS十二烷基磺酸钠,Sodiumdodecyl sulfate, 简 称SDS使DNA与蛋白质分离,在高温(55〜65C)条件下裂解细胞,使染色体离析, 蛋白变性,释放出核酸,然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂 质沉淀,离心后除去沉淀,上清液中的 DNAB酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀 水相中的DNA 一般生物体的基因组DNA为107~109bp,在基因克隆工作中,通常要 求制备的大分子DNA的分子量为克隆片段长度的4倍以上,否则会由于制备过程中 随机断裂的末端多为平末端,导致酶切后有效末端太少,可用于克隆的比例太低, 严重影响克隆工作。因此有效制备大分子 DNA的方法必须考虑两个原则:(1)尽量 去除蛋白质、RNA次生代谢物质(如多酚、类黄酮等)、多糖等杂质,并防止和抑 制内源DNase对DNA的降解。(2)尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
几乎所有的DNase都需要Mg2或Mn2+为辅因子,故实现(1)尽量去除蛋白质的 要求,需加入一定浓度的螯合剂,如 EDTA柠檬酸,而且整个提取过程应在较低温 度下进行(一般利用液氮或冰浴)。为实现(2)需要在DNA处于溶解状态时,尽量
减弱溶液的涡旋,而且动作要轻柔,在进行DNA溶液转移时用大口 (或剪口)吸管< 提取的DNA是否

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